RNA恒温快速扩增试剂盒（液体胶体金试纸条型）
使用说明书
【产品名称】
通用名称：RNA恒温快速扩增试剂盒（液体胶体金试纸条型）
【包装规格】
货号：WLRN5002
规格：100T
【原理概述】
本试剂盒基于一种常温恒温核酸快速扩增技术：在常温恒温下，特殊修饰的反转录酶利用特异性引物和模板RNA合成cDNA链，反应体系中的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA链为模板进行快速核酸扩增反应。依赖nfo酶的作用，加入根据模板设计的特异的分子探针，使用胶体金技术（三明治夹心法）可以对最终结果进行检测。
【引物设计】
建议使用长度在 30-35 bp的引物，引物过短会影响扩增速度和检测灵敏度；下游引物的5’端标记一个修饰基团
引物设计避免形成二级结构而影响扩增；扩增子长度建议在150-300 bp，通常不超过500 bp。
【探针设计】
探针序列不与特异性引物识别位点重叠，长度为46-52 nt，序列避免回文序列、内部二级结构和连续的重复碱基。探针共有三个修饰位点：5’端修饰一个抗原标记（典型FAM）;在5’端和3’末端的中部位置标记一个dSpacer（*，THF），作为nfo的识别位点；3’末端标记一个修饰基团，例如胺基、磷酸基团或C3-Spacer等。
【试剂盒组成】
组成 | 含量 |
C buffer | 1 mL×2管 |
L buffer | 500 μL×1管 |
PR-core | 1.2 mL×1管 |
N-core | 60 μL×1管 |
B buffer | 300 μL×1管 |
使用说明书 | 1份 |
【试剂盒储存】
1．运输温度：≤ 20 ºC的恒温环境；
2．储存条件：储存温度 ≤ -20 °C的恒温环境，避光保存，避免重压、反复冻融；
3．产品有效期：6个月；
4．生产日期见外包装。
【操作步骤】
提前将试剂盒所需组分取出，冰上或低温下融化（C buffer可室温融化），震荡混匀。
(1) 向无菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；
(2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探针，
(3) 加入1.5μL dNTPs(10 mM)；
(4) 加入12 μL PR-core和0.6 μL N-core（步骤1~4可以混合后再分装至反应管中）；
(5) 向反应管中加入3.8 μL核酸模板；
(6) 最后向反应管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（请务必上下颠倒甩动反应管8-10次进行混匀；对于多个反应，建议将B buffer加至反应管的盖子内侧上下颠倒后混匀）；
(7) 混匀后，将反应液甩（或快速离心）至管子底部，然后立即将反应管放入恒温设备中42 ºC孵育8-12 min；
(8) 反应结束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的离心管中，混合均匀后，将胶体金试纸条的样品端插入离心管中平衡，5 min内观察质控线与检测线判读结果。
体系配制
组分 | 体积（μL） |
C buffer | 20 |
L buffer | 5 |
PR-core | 12 |
N-core | 0.6 |
dNTPs(10 mM) | 1.5 |
下游引物(10 μM) | 2 |
下游引物(10 μM) | 2 |
探针(10 μM) | 0.6 |
核酸模板 | 3.8 |
B buffer | 2.5 |
总体积 | 50 |
【注意事项】
1. 由为保证液体试剂组分活性，请保证储存温度 ≤ -20 ºC；试剂使用时请保持低温，避免高温放置过长时间；
2. 在进行反应时请注意避免微量核酸染，并设置空白对照实验组。
