土壤中性蛋白/酶试剂盒-微量法正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义:
土壤蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氮的有机化合物的转化,其 水解产物是高等植物的氮源之一。S-NPT 在中性环境下催化蛋白质水解,与土壤有机质含量、氮素及其他土壤性质有关。
测定原理:
中性条件下,S-NPT 可将酪蛋白水解产生酪氨/酸;在碱性条件下,酪氨/酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;在 680nm 有特征吸收峰。
实验中所需仪器及设备:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、微量石英比色皿/96 孔板、双蒸水
土壤中性蛋白/酶试剂盒-微量法试剂组成和配置:
试剂一:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 6ml 蒸馏水充分溶解;用不完的试剂 4℃保存;
试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 2mL 试剂七,沸水浴加热溶解,然后加入 8ml 试剂一,充分混匀备用,用不完的试剂 4℃保存;
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 30ml 蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂 4℃ 保存;
试剂五:液体 8mL×1 瓶,4℃保存;
试剂六:液体 1.5mL×1 支,0.05mg/ml 标准酪氨/酸溶液,4℃保存; 试剂七:液体 5mL×1 瓶,4℃保存;
样品处理:
新鲜土样自然风干或 37 度烘箱风干,过 30~50 目筛。
土壤中性蛋白/酶试剂盒-微量法测定操作:
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 680nm,蒸馏水调零。
2、样本测定:
试剂名称 | 测定管 | 对照管 |
风干土样(g) | 0.02 | 0.02 |
试剂一(μL) | 150 | |
试剂三(μL) | 150 |
混匀后,40℃水浴 30min,振荡 5-6 次,使土样与反应液充分接触
试剂二(μL) | 50 | 50 |
混匀,8000g 25℃离心 10min,取上清液,在EP 管中加入下列试剂
测定管 | 对照管 | 标准管 | |
上清液(μL) | 60 | 60 | |
试剂六(μL) | 60 | ||
试剂四(μL) | 280 | 280 | 280 |
试剂五(μL) | 60 | 60 | 60 |
混匀,40℃水浴 20min,8000g 25℃离心 10min,取上清液 200μL,680nm 下读取各管吸光值 A
注意:标准管只需测一次。每个测定管设一个对照管。
土壤中性蛋白/酶试剂盒-微量法活性计算:
单位定义:每天每 g 土样中产生 1mg 酪氨/酸为一个 S-NPT 活力单位。
S-NPT(mg/d/g 土样)=C 标准×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×V 反总÷W÷T=24×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管
C 标准管:标准管浓度,0.05mg/mL;V 反总:反应体系总体积,0.4mL;T:反应时间,
30min=1/48d; W:样本质量,0.02g。