谷氨酸脱氢酶（GDH）检测试剂盒

谷氨酸脱氢酶（GDH）检测试剂盒紫外分光光度法活性检测说明书

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GDH（EC 1.4.1.2）广泛分布于植物中，和谷氨酸合成酶（GOGAT）共同参与谷氨酸的合成，在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。

测定原理：

GDH催化NH₄⁺ 、α-酮戊二酸和NADH，生成谷氨酸和NAD⁺，引起340nm吸光度下降。通过测定340nm吸光度的下降速率，计算GDH活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 支，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 支，4℃保存；

试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存。

谷氨酸脱氢酶（GDH）检测试剂盒粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

（1）工作液的配制：临用前将试剂二、三、四转移到试剂一中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；现配现用；

（2）取 0.05mL样本和1mL工作液于1mL比色皿中，混匀，加工作液的同时开始计时，在340 nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和5分20秒时的吸光度A2，计算 ΔA=A1-A2。

GDH 活性计算：

1、血清（浆）中 GDH 活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=675×ΔA

谷氨酸脱氢酶（GDH）检测试剂盒2、组织、细菌或细胞中 GDH 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=675×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V 样总) ÷T

=675×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GDH（nmol/min/10⁴cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样÷V样总×500) ÷T

=1.35×ΔA

谷氨酸脱氢酶（GDH）检测试剂盒V 反总：反应体系总体积，1.05×10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，50 0 万