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ELISA检测夹心法针对抗原分子上2个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物。
夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为:
1、将具有专一性的抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体
2、 加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结
3、 洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结
4、 洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结
5、洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果
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