小鼠视网膜色素上皮细胞

小鼠视网膜色素上皮细胞

细胞基本属性：

细胞简介：小鼠视网膜色素上皮细胞分离自眼组织；视网膜色素上皮为一层矮六角棱柱状细胞，高8～10μm，宽12～18μm。细胞顶部伸出许多长5～7μm的突起。在胚胎发生时，上皮基部和脉络膜紧密连接，但顶部与视细胞连接不紧，故易在此发生视网膜剥离。电镜观察，细胞之间有紧密连接、中间连接和缝隙连接，基底部有胞膜内褶和线粒体，故推测色素上皮有运输离子和屏障作用。胞核圆形，位于细胞基部。顶部胞质含许多椭圆或圆形的黑色素颗粒和含板层碎片的残余体。滑面内质网发达，分布于色素颗粒和残余体之间。有高尔基复合体、溶酶体、粗面内质网和脂滴。这些结构反映了色素上皮的多种功能：①色素颗粒由粗面内质网产生，经高尔基复合体转运至胞质顶部。已知两栖类和鱼类受强光照射时，色素颗粒移入突起中；处于黑暗时，色素颗粒又回到胞质中，这说明色素上皮有吸收光和保护视细胞免受强光刺激的作用；②脂滴有集聚和贮存维生SUA的作用，通过滑面内质网的酯化与转运，参与视细胞合成视紫红质；③能吞噬脱落的视杆细胞外节膜盘，藉溶酶体酶水解消化，形成残余体；④分泌蛋白多糖，粘合和维持视杆、视锥与色素上皮的相互位置关系，从而保证视紫红质的更新和营养物质的传递。

培养基：ECM基础培养基：，FBS，Penicillin，Streptomycin等；

包被条件：鼠尾胶原Ⅰ(2-5μg/cm2)

换液频率：每2-3天换液一次

消化液：0.25%胰dan白酶

培养条件：气相：空气，95%；CO2，5%

原代细胞培养方法：

1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。

2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。

3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青的混合液中30~60分钟。

4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。

5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。

6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。

7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。

8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶盖需拧松半圈。

注意事项：

1. 培养基于4℃条件下可保存3-6个月。

2. 在细胞培养过程中，请注意保持无菌操作。

3. 传代培养过程中，消化时间不宜过长，否则会影响细胞贴壁及其生长状态。

4. 建议客户收到细胞后前3天每个倍数各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和技术部沟通；由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，详尽告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪、回访直至问题得到解决。

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