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细胞冻存的步骤是什么?

2021年07月20日 10:48通派(上海)生物科技有限公司点击量:168

  细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。除此之外,还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。
 
  细胞冻存的步骤:
 
  1、选择活力好,密度约80%的细胞,此时细胞处于对数生长期,比较适合冻存。细胞冻存依旧分为贴壁细胞冻存和悬浮细胞冻存。
 
  2、显微镜下观察细胞状态,若细胞密度较高,培养基变黄,需要换液4h之后再进行冻存操作,细胞长满后,将培养皿中的培养基用枪小心的吸去。再用PBS冲洗一到两次,尽量吸干净润洗的PBS,加入胰酶消化细胞,消化一定要注意控制胰酶作用时间,消化细胞时由于每个细胞贴壁性不一样,消化时间差别会很大,胰酶消化是需要比较精细的操作,既要充分消化下细胞打散成单细胞悬液,均匀接种,又要避免消化过度造成细胞严重受损。大家用的胰酶活力及消化步骤、试剂都是不一样的,所以不能完全规定消化时间,一般仪个人经验为准。
 
  对于消化这步,建议按照下述操作:胰酶首先复温到室温后加入细胞,放入37℃培养箱,然后每隔30秒,吹打下细胞,如果能够吹打散细胞,说明细胞消化完成可以终止消化,之后混匀细胞时尽量轻柔,不要产生过多气泡。如果30秒不能分散,则再等30秒重复操作。
 
  3、消化完成后加6-8ML完全培养基终止消化,混匀细胞,收集细胞悬液。
 
  4、900-1000rpm离心3分钟,弃上清,加入配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,将细胞分装入冻存管中,每管1~1.5 ml,在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者,装有细胞的冻存管放入-4℃冰箱10分钟 ,然后放入-80℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。
 
  5、24小时后取出一只冻存管复苏,检查活性及是否污染。
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