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RT┐PCR分析肉芽组织生长过程中VEGF及β3整合素

2010年11月29日 17:11研域(上海)化学试剂有限公司点击量:1881

RT┐PCR分析肉芽组织生长过程中VEGF及β3整合素

血管生成指在已有血管床基础上长出新的毛细血管的过程,包括血管内皮细胞的激活,细胞外基质的降解,内皮细胞的增殖、移行,管腔结构形成及血管外膜的形成,然而迄今为止确切的机制尚不清楚.已有研究表明,许多病理过程如肿瘤的生长及转移、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎等,都与血管生成密切相关[1] .生理状态下,血管生成仅存在于胚胎发育、创伤愈合及女性生殖周期中,与病理性血管生成不同,这些过程中血管的生长受到严格调控,包括了增殖、成熟、退化三个阶段,反映了血管生成的全过程.然而,对这些过程中血管生成的研究却很少.生长因子和粘附分子作为血管生成的重要调节分子,越来越受到人们的重视,其中血管内皮生长因子(vas-cular endothelial growth factor,VEGF)和β3整合素是近年研究的热点.本实验旨在观察肉芽组织生长过程中VEGF及β3整合素mRNA的表达,揭示它们与生理性血管生成的关系.
    
  1 材料和方法
    
  1.1 材料  肉芽组织标本均取自我院门诊换药室患者,4例为皮肤撕脱伤,1例为狗咬伤,患者年龄20~30岁,排除糖尿病等影响伤口愈合的疾患,分别于伤后7~12d和30~35d取创面组织.正常皮下组织取自我院手术患者.
    
  1.2 试剂及仪器  异硫氰酸胍、Sarcosyl,AMV逆转录酶、Taq酶、dNTP,RNAsin分别购自原平生物公司和Promga公司;DNA THERMAL CYCLER480,美国PE公司;GDS凝胶成像系统,美国UVP公司.
   
  1.3 RT┐PCR
    
  1.3.1 引物设计  按文献报道[2,3],VEGF上游引物序列:5'-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3',下游引物序列:5'-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3',PCR产物为567bp,495bp和363bp,β3整合素上游引物序列:5'-GTGCT-GACGCTAACTGACC-3',下游引物序列:5'-CATGGTAGTGGAGGCAGAGT-3',PCR产物为285bp.
    
  1.3.2 总RNA提取及定量  所取组织用Chom-czynski改良一步法提取总RNA,通过测定A260 值计算RNA浓度,A260 /A280 判定纯度.
    
  1.3.3 RT-PCR反应  各组织总RNA均取1μg(10μL),加25μmol·L-1 逆转录引物(下游引物)1μL,70℃10min后立刻冰浴,加入下列成分:DW5μL,5x RT缓冲液5μL,10mmol·L-1 dNTP各1μL,RNasin0.5μL(25U),AMV1μL(5U),42℃逆转录1h,94℃5min,冰浴5min.各取RT产物10μL,进行PCR扩增,反应条件同于常规PCR,循环温度为:94℃1min,55℃1min,72℃2min,循环数分别采用15,20,25和30,根据结果选择合适循环数,避免PCR反应平台期,zui终确定为25个循环,0.2g·L-1 琼脂糖凝胶观察结果.
    
  1.3.4 荧光分析  琼脂糖凝胶电泳结束后,在UVP凝胶成像系统上摄像,并用相应软件通过对条带大小及深浅的差别分别对不同组织RT-PCR扩增产物进行定量分析,结果采用*随机化设计资料均数的t检验进行统计分析.
    
  2 结果
    
  VEGF有多种不同的mRNA拼接产物,本实验选用引物可扩增出VEGF121 (363bp),VEGF165 (495bp)和VEGF189 (567bp)3种形式.电泳结果表明,VEGF可见3条扩增带,大小同预期设计一致(Fig1)β3整合素PCR产物为265bp,电泳显示300bp附近可见明显扩增带,与预期一致(Fig2)由电泳结果可以看出,正常皮下组织中VEGF及β3整合素mR-NA水平极低,在增殖期肉芽组织中表达明显升高,在成熟期肉芽组织中表达又降低,而且,在VEGF的 3种不同拼接产物中,VEGF165 表达zui高.
   
  图像分析定量的结果表明,在增殖期肉芽组织中,VEGF及β3整合素mRNA水平高于成熟期肉芽组织(P<0.05)及正常皮下组织(P<0.01,Tab1).
    
  图1 - 图2  略
    
  3 讨论
    
  VEGF是近年发现的可以特异性作用于血管内皮细胞(EC)的生长因子.体外实验证明VEGF可以直接促进EC的增殖,还可以通过提高已有血管的通透性,使血浆蛋白渗入基质,利于EC的移行,间接促进血管生成[4] .β3整合素属粘附分子家族成员,可与αIIb或αV亚基结合,其中αVβ3分子在血管生成中的作用备受关注,表达于细胞膜表面,识别细胞外基质的RGD序列,对于EC的移行有重要意义[5] .本实验表明,正常皮下组织中没有血管生成的存在,VEGF及β3整合素mRNA的表达很低;在肉芽组织增殖期,HE切片证明EC在局部聚集成团,胞质增多,增殖明显,增殖的EC借助与细胞外基质的结合移行形成大量新生血管芽,此时VEGF及β3整合素水平明显增高,待肉芽组织*成熟后,新生血管逐渐成熟退化,二者的表达也随之下降,表明VEGF及β3整合素可能是血管生成重要的始动分子,对于维持血管生成也有重要作用;同时也提示它们可以作为临床血管生成治疗的“靶分子”.VEGF及β3整合素受控表达的机制尚不清楚,缺氧及某些炎症因子可能参与其中的调节[6,7] .
    
  表1 不同组织中VEGF及β3整合素mRNA表达水平的定量分析结果 略
          
  RT-PCR适于用Northern blot检测不到的低丰度RNA.实验证明,同一循环体系下,模板量在一定浓度范围内时,PCR产物条带强度与模板量成比例关系;当循环次数处于PCR扩增的对数增长期时,PCR产物的荧光强度同模板量亦成比例关系[8] ,因此用RT-PCR定量分析mRNA的关键是严格优化实验条件,如模板量及循环次数的控制等,本实验重复几次结果一致.
 

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