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泽泻探针法PCR鉴定试剂盒试验循环参数

时间:2025/3/17阅读:20
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泽泻探针法PCR鉴定试剂盒试验循环参数: 
1.  预变性(Initial denaturation)
模板DNA变性与PCR酶的激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2.  循环中的变性步骤
循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间,变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不好,易造成扩增失败。

3.  引物退火(Primer annealing)
退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4.  引物延伸
引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略
延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000 bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1 min/kbp。

5.  循环数
大多数PCR含25-40循环,过多易产生非特异扩增。

6.  最后延伸
在最后一个循环后,反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸,并使单链产物退火成双链。

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