ELISA实验中本底及假阳性产生的原因分析

1. 基因工程抗原与合成肽抗原的区别
1.1 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：
a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。
b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使试剂盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的试剂盒效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。
c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高试剂盒的灵敏度，提高检出率。
d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。
1.2 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点：
a.分子量太小
b.一般只含有一个抗原决定簇
c.纯度高
d.稳定性差
由于基因工程抗原较于合成肽抗原有*的*性，ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。就HCV ELISA 试剂盒来讲，*代产品为合成肽抗原，主要是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV 特异性抗原。第三代试剂的敏感度大大提高了。
由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应试剂盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类试剂盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。值得欣慰的是也有厂家坚持试剂盒高的流行病学敏感度，科学得对待反应结果。
2．假阳性本底产生的原因
2. 1 抗原因素
2.1. 1 融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断试剂盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列，因此可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。
2.1.2 错误排序的影响。合成肽在制备过程中，如果某些肽序列错误，会导致合成肽特异性改变而产生假阳性。另外，在构建基因工程表达载体时引入的HCV 核苷酸发生相位改变或点突变也会对抗原的特异性产生不利的影响，但由于基因工程技术的不断进步，由工艺原因造成的抗原特异性降低会逐渐被克服。
2.2. 3 抗原纯度对特异性的影响。以HCV 抗原为例，利用大肠杆菌大规模表达后需经破碎细胞、盐析、粒子交换柱等分离纯化步骤才能zui后的到一定纯度的HCV 抗原。目前的工艺还不能做到抗原纯度为100％，因此抗原中还混有大肠杆菌的其它杂蛋白，受过大肠杆菌感染的人，血清中的抗大肠杆菌抗体可和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性。
2.2 人血清中的正常IgG
人血清中IgG 的浓度对HCV 试剂盒有较大的影响。HCV 试剂盒采用的间接法，酶标抗抗体能与人所有IgG 结合，而IgG 吸附于板孔的能力很强，因此我们采用100 微升样稀加10 微升血清来将其稀释以降低本底。到成人时，据统计学调查，成人的IgG 为12mg/ml，而有些人的IgG 浓度会远远高于此，这部分人的血清经ELISA 反应后往往会显色。
2.3 人血情中异常的IgG
结缔组织病（系统性红斑狼疮、多发性骨髓瘤等）等病症时，血清中的风湿小体和其它异常IgG（IgG 浓度达到50mg/ml）会引起本底升高或假阳性。
2.4 溶血的影响
当溶血时，红细胞中的血红蛋白释放到血清中，血红蛋白具有过氧化物酶的性质，当其通过吸附或“PP 效应”（蛋白质间相互吸附的现象）结合后，可催化A、B 液显色而造成假阳性。
2.5 操作不当引起
任何操作不当都会影响结果，因此在操作过程中保证操作的规范，严格按照说明书进行是得到准确结果的关键和基础。
2.5.1 加样
2.5.1.1 样品稀释液少加，或血清多加，都会引起本底增高。对于间接法来说，受上述两个因素影响更大。因为血清中受检的特异性IgG 只占总IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很强，非特异IgG 可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。这些非特异的IgG均可以和酶标二抗发生反应而造成较高阴性本底或假阳性。如果加入的血清过多，高于规定的稀释倍数，必将带来阴性高值。
2.5.1.2 酶结合物的不正确加入。一般来讲，酶也有一定的非特异吸附，将包被好的酶联板再封闭，一方面也可避免酶的非特异性吸附。通常每孔加入的封闭液为120μl。如果加入的酶多于120μl 或加在较高的孔壁上或孔口，也会引起本底升高或假阳性。
2.5.2 温育
5.2.1 由于试剂盒确定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点，升高反应的温度，会加快反应，同样增加时间会延长反应，这样得到的反应程度会比试剂盒确定的反应程度多，也会引起阴性高值或假阳性。
5.2.2 由于试剂盒通常设定的反应温度为37 度，在这个温度下放置30 分钟，蒸发的水分会很多，对于整个反应体系来讲，各种反应物的浓度会不断增加，这样必会导致反应zui后的值升高。因此温育时应盖上胶贴。
5.2.3 试剂盒在设计时，反应是在静置条件下完成的，如果反应改变为振动条件，会加快分子的热运动，增加反应的机会。
5.2.4 试剂盒的温育过程是在培养箱中进行，这和水浴的条件不一样。水浴可是酶联板迅速升温，但较难将温度控制在较稳定的温度，往往高于37 度，同样会引起高值阴性。
2.5.3.洗板
2.5.3.1 各个厂家使用的洗液配方是不同的，是根据各自试剂的条件配制的，采用不配套的洗液常会得到不正常的反应结果，包括本底过高。本公司的洗液采用*的洗涤系统不能和其它公司的试剂盒混用。
2.5.3.2 试剂盒中提供的洗液是浓缩的，应该稀释到规定的倍数使用，过多稀释洗液，会影响洗液的效果，而使反应的本底过高。
2.5.3.3 稀释洗液的水应该是新鲜的蒸馏水，电导率小于1.2μs。如果水中含有过多的Ca2+、Mg2+，这些离子会占用表面活性剂，影响洗涤效果。
2.5.3.4 洗板时，应每孔加满洗液，如果加入的洗液液量不够，对洗涤的效果影响也是很大的。本公司的酶联板板孔为400μl，比别的厂家的板孔大，因此洗了别公司的板后要及时调整液量，以避免加液量不满。
2.5.3.5 洗板的次数不够孔内多余的抗原（抗体）或酶结合物不能*去除，也会因此本底升高。
2.5.3.6 洗板的强度和洗板的浸泡时间是密切相关的。洗板机不同，使用的泵不同，液体加入时的冲力不同。如果加入洗液的冲力不大，也没有设定浸泡时间，同样会使结果的A 值偏高。
2.5.3.7 洗板完毕后，要进行拍板，尽量采用质量好的毛巾和吸水纸，使用易掉渣的纸，纸屑会留在板孔中，由于纸屑中含有氧化剂而造成高值阴性。
2.5.4 显色。加A、B 液准确，顺序不能颠倒，要及时终止显色。终止后要在3 分钟内读数，否则强阳性会变低。
2.5.5.枪头、加样槽或其它来源的污染
如果使用的枪头、加样槽是反复使用的，必须肯定其没有来自酶或阳性的污染。酶作为反应的催化剂，及其微量也会很明显影响反应。反复使用的枪头、加样槽清洗不当，也会干扰反应。如将枪头使用84 消毒液浸泡而没有冲洗干净，因为84 是强氧化剂，加入AB 液后就会显色。同样枪头和加样槽不正确清洗，改变加入试剂的PH 值，反应的结果也会不正常。常常有人用手纸将加样槽擦干，但是如果使用的手纸容易掉渣，会将纸上的强氧化剂留在槽中而影响反应。
2.5.6.测A 值时，微孔条底部不透明、带水滴、有划痕及不规则的表面都可能引起A 值的升高。