14,15-DHET Hypertension ELISA测量方案

这种竞争性ELISA试剂盒用于测定生物样品中的14,15-DHET水平的特异性ELISA已经发表。14,15-DHET水平与高血压、脑组织啮齿类动物的损伤和中风。14,15-DHET是可溶性环氧化物水解酶介导的代表性代谢产物EET的代谢，其由细胞色素P450的花生四烯酸环氧合酶活性产生。人类使用14，15-DHET ELISA试剂盒测量血液14，15-DHET水平。增加14,15-DHET水平通过14，15-DHET ELISA检测到的人细胞表明癌细胞。

本试剂盒可用于测定血清、血浆、细胞和组织中的14,15-DHET分离和纯化。以下几页提供了关于正确隔离和纯化的说明。这种竞争性ELISA试剂盒，基于14,15-DHET表位和14,15-DH ET-HRP缀合物之间的竞争对于可从抗14，15-DHET抗体获得的有限数量的结合位点，其被涂布到96孔ELISA板。共轭物浓度在每个孔中保持恒定，而14，15-DHET是可变的，基于样品或标准物的浓度。因此，14,15的数量-能够与每个孔结合的DHET缀合物与14，15的浓度成反比-标准品或样品中的DHET。结合到每个孔的缀合物的量然后由当添加TMB时所获得的颜色的量。TMB与井中可用的HRP反应。使用加入硫酸，蓝色的产物转化为黄色的产物，可以在450纳米的平板读数器。

14，15-DHET是可溶性环氧化物水解酶（sEH）介导的EET代谢的代表性代谢产物，由细胞色素P450（CYPs）2C和2J的花生四烯酸环氧合酶活性产生。这种竞争具有HRP系统的ELISA试剂盒已用于测定生物样品（组织，血浆和尿液）和细胞培养基。使用艾美捷14,15-DHET Hypertension ELISA#DH1，已发现强正相关发现高血压、脑损伤和中风患者的14,15-DHET水平，转移性脑脊髓炎患者的EET水平癌细胞表型和胰岛素抵抗。下一代高血压药物的发现在几个实验室进行。96孔板的每个试剂盒适用于顶多24个样品的一式三份分析。

储存和稳定性：

如果所有组件在使用前都储存在适当的温度下，该套件将获得较佳效果。项目应在收到此试剂盒后在指-定温度下储存。所有成分都储存在-20°C以下，不应过度冷冻和解冻。

注意事项：

▪ 在开始分析之前，请仔细阅读所有说明。

▪ 该试剂盒中的试剂经过测试和配制，以达到极-佳效果。此套件可能不起作用如果更换了任何试剂或修改了任何程序，则正确。

▪ 本试剂盒仅供研究使用，不得用于诊断。

程序性说明：

▪ 移除所有需要的试剂，包括TMB，并使其平衡至室温在进行测定之前。

▪ 有必要将浓缩的缓冲溶液充分混合。每个缓冲液中包含一个搅拌棒解决方案

样品制备：

根据14,15-DHET所处的介质，有不同的分离和纯化方案。下面列出了不同的协议。为了获得较好的结果，遵循基于生物学的适当方案样品存在：

14,15-DHET在细胞中的测量

1.使用含有终浓度约0.1 mM TPP（三苯基膦，0.03-0.05 mg/mL）的溶液收集并匀浆和/或超声处理细胞。TPP是一种抗氧化剂，看起来像沉淀在样品中，因为它不容易溶解。在使用含有TPP的储存样品之前，旋转样品以从样品溶液中分离沉淀的TPP。

2.用乙酸将整个均化的细胞酸化至约3-4的pH。测量使用标准pH纸。

3.用乙酸乙酯萃取。向均质细胞中加入等体积的乙酸乙酯涡流非常好。离心后，将上层有机相放入新鲜干净的试管中。然后添加将另一等体积的乙酸乙酯加入均化细胞中，开始第二次提取。强烈建议进行三次提取

4.从提取物中蒸发合并的乙酸乙酯，直到所有乙酸乙酯都在氩气或氮气下干燥。

5.皂化（如需要）（见下文）

6.向20μL乙醇或N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中加入10μL，以重组上述步骤#4的干燥残留物。加入0.5 mL 1x样品稀释缓冲液（试剂盒中提供）。在ELISA平板上，每孔加载100μL，一式三份。（注意：我们建议测量不同的稀释度样本，试图将结果拟合到标准曲线。例如，添加3个孔，其中50μL为样品加50μL 1x样品稀释缓冲液，3孔，其余样品加90μL，10μL1x样品稀释缓冲液。）

7.进行14,15-DHET的ELISA（根据制造商的说明）

皂化作用（从甘油骨架上裂解脂肪酸）：

1.将干燥的脂肪酸（从3X乙酸乙酯提取物中获得）溶解在2 mL 20%KOH溶液中（制作工作溶液：1 mL 2 M KOH+4 mL甲醇，使KOH的最终浓度=0.4 N）。

2.涡旋并在50°C下孵育1小时。

3.向溶液中加入1.5 X H2O，并用20%甲酸将pH调节至pH~5。

4.用乙酸乙酯（1份水溶液+1份乙酸乙酯）重新提取溶液并干燥。

14,15-DHET在组织中的测量

1.将1g组织、4mL H2O和0.01mg TPP均匀化。

2.通过向每个匀浆中加入8μL乙酸来酸化匀浆。

3.用等量的乙酸乙酯提取，彻-底涡旋，向下旋转，收集有机物阶段再重复两次提取，将所有有机相合并。

4.用氩气或氮气干燥有机相。

5.皂化（如果需要）（参见细胞中的14,15-DHET测量）

6.用乙醇或DMF溶解来自上述步骤#4的干燥残留物。（添加约20μL乙醇或DMF以重新构成干燥的残留物。）

7.用1x样品稀释缓冲液进一步稀释：加入约0.5 mL 1x样品稀释剂缓冲并在室温下以10000rpm离心5分钟。上清液将用于ELISA。

8.进行14,15-DHET的ELISA（根据制造商的说明）。

化验准备：

提供了固体96孔板和TMB溶液，以便随时使用。其他化验试剂的制剂为详细内容如下。

洗涤缓冲液：将溶液混合，用小火加热，直到得到透明无色的溶液。稀释整个用225毫升去离子水洗涤缓冲浓缩物（25毫升）的含量，得到250毫升的最终体积1倍洗涤缓冲液。然后可以在试剂盒的整个使用寿命内对其进行冷藏。

HRP缀合物：用12.00 mL的1X HRP缓冲液稀释1小瓶14,15-DHET-HRP缀合物（0.012 mL）。一个小瓶就足以制成一个盘子的共轭物。共轭物必须在同一天使用，不应储存以备日后使用。

标准：将5根微管标记为标准1至标准5。稀释样品稀释液的全部内容储备缓冲液（25 mL）和225 mL去离子水，得到最终体积为250 mL的1倍样品稀释液缓冲器将0.9 mL样品稀释缓冲液加入标准品1至5的微管中。降速封闭

14,15-DHET标准小瓶（2μL，填充惰性气体），加入1.998 mL样品稀释缓冲液，获得2 mL解决方案。给本标准贴上标签6。将0.1mL标准品6添加到标有标准品5的微管中并混合非常接下来，将0.1mL标准品5加入标有标准品4的微管中，并充分混合。继续到使用1:10稀释液对其余标准品进行连续稀释。

样品：如果样品在溶液中，可以直接稀释到1倍样品稀释缓冲液中。用于提取和干燥的样品，建议用最少量的N，N二甲基甲酰胺乙醇（DMF，10μL至20μL）溶解干燥的样品并充分涡旋。ELISA测定前，加入100μL的1 X样品稀释缓冲液，使储备样品溶液准备好用ELISA进行定量。库存样品溶液可以进一步稀释到用于ELISA测试的适当浓度范围。