谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B使用说明书

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B使用说明书由上海远慕生物详细介绍，本司现货供应ELISA试剂盒，标准品对照品，动物血清，培养基，抗体，细胞株，琼脂糖凝胶，葡聚糖凝胶，多肽，酶类，碳水化合物，生物分子，微生物，生化试剂，化学试剂，实验耗材，染色液，其他试剂等，欢迎订购！

【谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B参数说明】

中文名：谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B

英文名：Glutathione Sepharose 4B 

供应商：上海远慕

规格：10ml、50ml

操作温度：4-40℃

结构成分：4%交联琼脂糖

配基偶联量：40μmol phenyl/ml 凝胶

保存条件：4℃

性状：白色微球，凝胶状，保存在20%酒精溶液中

应用：疏水层析介质，适合含芳香族配体蛋白纯化，特别适合单抗的纯化等

谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B使用说明

【谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B使用方法】　

谷胱甘肽树脂的处理：

1、轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。

2、取部分匀浆放入15mL聚丙烯管(每100mL细菌培养物大约需要2mL匀浆)。

3、4℃500g离心5分钟，小心去掉上清。

4、在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS，颠倒数次混匀，4℃500g离心5分钟，小心去掉上清。

5、每毫升树脂加入1毫升冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。

制备细胞抽提物：

1、每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mLPBS缓冲液中。

2、加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。

3、用针筒将10mL浓度为0.2%的TritonX-*行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀；加入DNase和RNase至终浓度5ug/mL,4℃振动温育10分钟，4℃3000g离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT至终浓度1mmol/L。

纯化融合蛋白：

1、细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和，每100毫升细菌培养物加2mL树脂，于室温轻摇30min。

2、混合物于4℃以500g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3、沉淀中加入10倍柱床体积的冷的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白。

4、4℃以500g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5、重复步骤11和12两次。

6、结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱液洗脱，也可用凝血酶、肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白。用谷胱甘肽洗脱融合蛋白：

7、沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min，洗脱树脂小心去掉上清。

8、每毫升树脂加入1毫升冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。制备细胞抽提物：

9、每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mLPBS缓冲液中。7.加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。

10、用针筒将10mL浓度为0.2%的TritonX-*行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。加入DNase和RNase至终浓度5ug/mL,4℃振动温育10分钟，4℃3000g离心30分钟，去除不溶性细胞碎片，上清转移到一只新管中，加入DTT至终浓度1mmol/L。

纯化融合蛋白：

1、细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和，每100毫升细菌培养物加2mL树脂，于室温轻摇30min。

2、混合物于4℃以500g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3、沉淀中加入10倍柱床体积的冷的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白。

4、4℃以500g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5、重复步骤11和12两次。

6、结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱液洗脱，也可用凝血酶、肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白。

用谷胱甘肽洗脱融合蛋白：　

1、沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min，洗脱树脂上结合的蛋白。

2、4℃以500g离心5分钟，上清(含洗脱的融合蛋白)移至新管中。

3、重复步骤a和b两次，合并3次上清。蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：

4、在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或Xa因子(根据融合蛋白中的位点选择)，每mL树脂加入50单位溶于1mLPBS的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2—16小时。用小规模实验确定时间。19.4℃以500g离心5分钟，上清小心移至新管中。(GST仍结合在树脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中，仍需要分离)20.10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步样品的蛋白质组成。

试剂配制：

谷胱甘肽洗脱缓冲液：10mmol/L还原型谷胱甘肽，50mmol/LTris-Cl(pH8.0)

相关试剂：

PMSF(100mM)

溶菌酶(100mg/mL)

IPTG溶液(50mg/mL)

1MTris-HCl(PH=8.0)

SDS-PAGE凝胶制备试剂盒

His标签纯化树脂(Ni-NTAResin)

预染低分子量蛋白MARKER

BCA蛋白浓度测定试剂盒

【谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B说明】

pGEX载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。GSTs是一类以谷胱甘肽(γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸)作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由于GST对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高。可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST融合蛋白；树脂用3mol/LNaCl的缓冲液再生；谷胱甘肽琼脂糖对GST融合蛋白的结合能力很强(每毫升柱床体积的树脂能结合8毫克融合蛋白)。

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