支原体PCR检测实验报告

1.0 物品、试剂：
10ul及200ul tip头、0.2ml PCR薄壁管、管架、手套；
DEPC处理水、Ex-Taq试剂盒（包括PCR Buffer、MgCl2、Taq酶）、DNA marker均另购，
引物/dNTP混合物(primer/Nucleotide Mix)、阳性对照DNA (Positive Control DNA)、内标DNA (Internal Control DNA) 为普飞生物提供的VenorGem试用装中所含。
2.0实验方法：
2.1样品的准备：
样品：细胞的新鲜培养物上清，小牛血清。
分别取两种样品各100ul至灭菌1.5ml离心管中，将管盖盖紧。置95℃保温5分钟，短暂离心（5 sec）。
2.2 试剂的溶解配制：
将装有以下试剂干粉的离心管离心，向管中加入DEPC处理水，充分摇匀溶解后再短暂离心。以下为各组分的加水量：
引物/dNTP混合物 (Primer/Nucleotide Mix) 55ul
阳性对照DNA (Positive Control DNA) 50ul
内对照DNA (Internal Control DNA) 50ul
2.3 PCR混合物：
向0.2ml PCR薄壁管中依次加入以下组分，

PCR组分（单位：ul）
负对照管

内对照管

阳性

对照管

牛血清

检测管

发酵液

检测管

水

28.8

26.8

24.8

24.8

24.8

10×PCR Buffer

5

5

5

5

5

MgCl2（25mM）

6

6

6

6

6

引物/dNTP混合物

10

10

10

10

10

内对照DNA

－

2

2

2

2

阳性对照DNA

－

－

2

－

－

处理后样品

－

－

－

2

2

Taq酶（5U/ul）

0.2

0.2

0.2

0.2

0.2

总体积

50

50

50

50

50

盖紧管盖，轻弹管壁混匀，稍加离心。
2.4热循环程序：
将准备好的PCR管放入PCR仪，运行如下程序
94℃ 2min

1个循环

94℃ 30sec

35个循环

55℃ 30sec

72℃ 30sec

降温至4~8℃

2.5凝胶电泳：
支原体PCR检测实验报告1.2％琼脂糖凝胶电泳，TBE缓冲液，PCR产物及Marker均点样5ul，于50V下电泳1hr，EB染色15min，紫外灯下观察。
3.0结果分析：
电泳结果见图。

图中泳道M为DNA Marker，1为负对照管PCR产物，2为内对照管PCR产物，3为阳性对照管PCR产物，4为牛血清检测管PCR产物，5为发酵液检测管PCR产物。

负对照管PCR产物无带，内对照管在191 bp处有一条带，阳性对照管在278 bp处有一条带，证明本次实验准确可靠。两样品检测管均只有一条与内对照管相同位置的条带，说明样品检测管PCR反应并未受到抑制，且不含支原体。