2014年11月10日 08:49上海士锋生物科技有限公司点击量:1622
1、毕氏酵母氯化锂转化法
(1)试剂
1MLiCl(用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌;必要时用消毒去离子水稀释)
50%PEG3350(SigmaP3640用去离子蒸馏水配制,滤膜过滤除菌,用较紧的盖子的瓶子分装)
2mg/mlsalmonspermDNA/TE(10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA)-20℃保存
注:醋酸锂对毕氏酵母无效,仅氯化锂有效;PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用;
(2)感受态毕氏酵母的制备
接种Pachiapastoris到50mlYPD培养基中,30℃摇菌过夜(约24~28h)培养到OD值为0.8~1.0(约108Cells/ml);
收获细胞,用25ml无菌水洗涤一次,室温下1500g离心10min;
重悬细胞于1ml100mMLiCl溶液中,将悬液转入1.5ml离心管;
离心机zui大速度离心15秒沉淀菌体,重悬菌体于400ul100mMLiCl溶液中;
按50ul/管分装,立即进行转化;
注:不要将感受态酵母菌冰浴;
(3)毕氏酵母的转化
煮沸1ml鲑鱼精DNA5min,迅速冰浴以制备单链担体DNA;
将感受态酵母菌离心,以Tips去除残余的LiCl溶液;
对于每一个转化,按以下顺序加入:
50%PEG3350240ul
1MLiCl36ul
2mg/ml单链SalmonspermDNA25ul
5~10ug/50ulH2O质粒DNA50ul
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