液相色谱与化学计量学方法联用

　　近年来氨基酸分析在生物化学、药学和临床研究上都有着广泛而重要的应用.氨基酸的分离,尤其是氨基酸对映体的分离一直是国内外的研究热点.在手性分离这一领域,液相色谱法（HPLC）一直是zui广泛使用的方法.
　　
　　目前液相色谱分离手性化合物主要有两种方法:一种是直接分离法,也就是利用手性固定相直接分离手性化合物对映体.王亚丽[1]等曾用纤维素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC）手性柱在正相模式下拆分了3种外消旋氨基酸的衍生物.另一种是间接分离法,目前主要是柱前衍生化法———将手性化合物柱前衍生化,将对映体转化为非对映体,进而使用常规柱完成分离分析.
　　
　　本文主要讨论使用柱前衍生法分离多种氨基酸的对映体,并将化学计量学方法引入丝氨酸对映体重叠峰的分析,可以一次性地定量分析多种氨基酸对映体.所用衍生剂为邻苯二甲醛（OPA）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）[2,3].NAC是一种手性硫醇,其它手性硫醇如N-乙酰-D-青霉胺（NAP）、N-异丁酰-L-半胱氨酸（IBLC）、N-异丁酰-D-半胱氨酸（IBDC）[4]也可与OPA一起做为衍生剂.
　　
　　1实验部分
　　
　　1.1试剂与仪器
　　
　　DL-丝氨酸（上海亿欣生物科技有限公司）;L-丝氨酸、β丙氨酸、DL-丙氨酸、L-丙氨酸、DL-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、DL-缬氨酸、L-缬氨酸、硼酸、氯化钾、氢氧化钠、乙酸钠（中国医药集团上海化学试剂公司）;邻苯二甲醛（以下简称OPA,中国医药集团上海化学试剂公司）;N-乙酰-L-半胱氨酸（以下简称NAC,Lancaster公司）;甲醇（HPLC级,Merck公司）;高纯水.除甲醇和水外其他试剂均为分析纯.
　　
　　美国AglientHP1100液相色谱仪（DAD检测器）,ChemStation化学工作站.
　　
　　美国Aglient8453UV-Vis光谱仪.
　　
　　1.2样品预处理[5]
　　
　　各氨基酸样品配制成浓度约为0.01M的水溶液.硼酸缓冲液的配制:硼酸（0.01M）、氢氧化钠（0.01M）和水按体积比50∶45∶5配制得到pH为9.3的硼酸缓冲液.衍生剂的配制:将53.3mgOPA溶于50mL甲醇得到OPA甲醇溶液.NAC溶于硼酸缓冲液中（0.00286M）.取12mLOPA甲醇溶液、10mLNAC硼酸溶液,添加3mL硼酸缓冲液至25mL,得到OPAPNAC衍生剂.
　　
　　1.3衍生反应
　　
　　将0.1mL氨基酸与5mLOPAPNAC衍生剂*混合5min后过滤进样分析.
　　
　　1.4色谱条件
　　
　　ZORBAXEclipseXDB-C8色谱柱（4.6mm3150mm,5μm）.
　　
　　不同比例的甲醇和0.05M醋酸钠水溶液为流动相,流速1mL·min-1,进样量20μL.
　　
　　所有的色谱分离均在室温下进行,在线检测波长为334nm,DAD检测波长范围为190～400nm.
　　
　　非负矩阵因子分解（NMF）计算截取的数据波长范围为320nm～390nm.
　　
　　1.5数据处理方法
　　
　　本实验采用非负矩阵因子分解（NMF）[6]计算两个混合组分的纯谱.非负矩阵因子分解是在“非负”
　　
　　限制约束条件下的一种矩阵分解新方法,它的基本思路是将非负矩阵V分解成两个非负因子矩阵W和H.NMF
　　
　　算法中采用了乘法更新公式（见公式（1）和（2））,所以不必采用其它限制条件即能保证分解结果“非负”.
　　
　　2结果与讨论
　　
　　2.1氨基酸对映体的分离
　　
　　氨基酸与衍生剂的反应生成异吲哚类产物[7],.由紫外测量得到的图谱可看出,此类衍生产物在230nm和334nm处各有一个zui大吸收）.但由于230nm处较易受干扰,故在色谱实验中除了记录全波长数据外,选择334nm作为检测波长.
　　
　　下文中所提到的氨基酸色谱峰均为其经过上述衍生化后所得到的衍生物的色谱峰.
　　
　　实验结果表明,在甲醇∶醋酸钠溶液为30∶70的淋洗条件下,除DL-丝氨酸的两种对映体有部分重叠外,DL-丙氨酸、DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸的对映体能得到基线分离,但是DL-缬氨酸的两种对映体出峰时间为17min和25min,DL-苯丙氨酸的两种对映体出峰时间为38min和43min.此分离条件下,不仅浪费流动相,而且峰形不理想.如果将流动相的比例调节至45∶55，虽然可使DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸的对映体在10min内洗脱出峰,但将使DL-丝氨酸及DL-丙氨酸*或部分重叠.
　　
　　考虑到DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸保留过强的情况,操作中采用了简单的梯度淋洗,在前三种氨基酸全部出峰后,改变流动相配比使DL-缬氨酸和DL-苯丙氨酸快速出峰.淋洗方案如下:在0～6min内保持甲醇∶醋酸钠溶液为30∶70不变,在6～7min由此比例线性变化至45∶55,在7min以后保持45∶55不变.
　　
　　各对对映体的定性采用左旋光学纯标样通过内标法确定.β丙氨酸没有手性,没有对映异构体,只有一个色谱峰.
　　
　　2.2波谱解析法的使用
　　
　　尽管采用梯度洗脱,此谱中仍有一对重叠峰—丝氨酸的两个对映体.在这种情况下,如果要定量分析此体系,知道两组分的实际峰面积是必需的.我们使用非负矩阵因子分析解析出两组分的纯谱（见图4）,但此结果与实际纯谱还存在一个系数关系,即AXD-SerBXL-Ser=YDL-Ser.为得到两组分实际的纯谱,我们用zui小二乘回归（leastsquaresregress,LSR）来计算系数A和B,得到的结果如下（见图5）:A=72.59;B=75.98.此系数乘以各自组分的纯谱即为两组分的实际峰面积.
　　
　　2.3各对映体的定量分析
　　
　　2.3.1标准曲线的建立
　　
　　采用单一对映体标样在不同浓度值下的色谱峰面积或峰高建立标准曲线.
　　
　　实验中选用L-丙氨酸和L-苯丙氨酸作为两种标样,L-丙氨酸对应甲醇∶醋酸钠=30∶70的色谱条件,L-苯丙氨酸对应甲醇∶醋酸钠=45∶55的色谱条件.以浓度对峰面积或峰高进行线性拟和,得到标准曲线方程（见图6,7）.通过此方程可以测定混合样品中两个标样组分的浓度.
　　
　　2.3.2其它组分相对浓度预报
　　
　　在同样的色谱条件下,体系中各组分的含量比与其色谱峰面积比成线性关系.各组分的峰面积和所占面积面分比结果见表1,其中D-丝氨酸和L-丝氨酸的单峰面积是根据上述化学计量学方法计算而得.
　　
　　3结论
　　
　　本文运用柱前衍生化法使用常规反相液相色谱实现了4种氨基酸对映体的拆分,达到了较好的分离效果,并实现了多组分定量分析.文中所用的淋洗方案也比较简单.使用计算方法解析重叠峰相对降低了对色谱峰分离度的要求,这对于分析更加复杂的样品体系是很有帮助的。