ELISA试剂盒检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预
先包被*原前体蛋白（PIVKA-II）抗体的包被微孔中，依次加入
标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并*洗涤。用底物
TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下
转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的*原前体蛋白
（PIVKA-II）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD
值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞
刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地
分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟
取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于
-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
1. 酶标仪（450nm）
2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒温箱
操作注意事项
1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20 分钟。从冰箱取出的
浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶*溶解
后再使用。2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3. 浓度为0 的S0 号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明
书操作时样本已经稀释5 倍，zui终结果乘以5 才是样本实际浓度。
4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5. 所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒组成
名称96孔配置48孔配置备注
微孔酶标板12 孔×8 条12 孔×4 条无
标准品0.3mL*6 管0.3mL*6 管无
*6mL 3mL 无
检测抗体-HRP 10mL 5mL 无
20×洗涤缓冲液25mL 15mL 按说明书进行稀释
底物A 6mL 3mL 无
底物B 6mL 3mL 无
终止液6mL 3mL 无
封板膜2 张2 张无
说明书1 份1 份无
自封袋1 个1 个无
注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、5、10、20、40、80 AU/ml
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20 稀释，即1 份的20×洗涤缓
冲液加19 份的蒸馏水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置1min 后甩尽
孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板5 次。
2. 自动洗板机：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5 次。
ELISA试剂盒操作步骤
1. 从室温平衡20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封
袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3. 样本孔先加待测样本10μL，再加*40μL；空白孔不
加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶
（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴
锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5 次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物A、B 各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL，15min 内，在450nm 波长处测定各孔的
OD 值。
结果判断
绘制标准曲线：在Excel 工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应
OD 值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样
本浓度值。
试剂盒性能
1. 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数R 值，大于等于
0.9900。
2. 灵敏度：zui低检测浓度小于1.0 AU/ml。
3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4. 重复性：板内、板间变异系数均小于15%。
5. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6. 有效期：6 个月
ELISA试剂盒免责声明
1. 试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所
产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2. 严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者
承担。
