近年来，人类组织干细胞的研究已成为国内外学者关注的焦点，表皮干细胞即是其中之一。表皮干细胞是一种在成年期还能维持较高的自我更新能力的细胞群，在正常状态下维持表皮的自我更新，当受到损伤刺激时，表皮干细胞可以参与皮肤损伤的修复[1]。随着人口老龄化速度加快，慢性溃疡及皮肤病患者日益增多，加之烧伤及意外创伤造成的皮肤缺损，临床对皮肤移植的需求越来越大。由于表皮干细胞数量少,缺乏明确的特异性分子标志,体外培养很容易丢失其干细胞生物学特性，增加了分离培养的难度。获得大量高纯度的表皮干细胞成为该领域研究的关键技术。我们根据几年来在细胞培养方面的工作实践，将人表皮干细胞的培养技术总结如下。
1 人表皮干细胞的分离与培养
应用IV型胶原快速粘附法从手术切除的人包皮组织中分离表皮细胞中的快速粘附细胞，这一群细胞被认为是表皮干细胞，它具有快速粘附、缓慢生长的特点[2]。取年龄在5～25岁无泌尿系统感染患者的包皮皮片，无菌条件下去除皮下脂肪层，用含*、*的PBS反复冲洗皮片数次，修剪成大小约0.5 cm×0.5 cm的皮片，置于培养皿中，加入0.25%*10 ml，4℃消化l4～16 h，吸弃上清，分离表皮和层。剪碎表皮，用0.25%*+0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化，37℃，10 min，加入含有10%胎牛血清的DMEM终止消化，反复吹吸至细胞悬浮，200目筛网研磨过滤。滤液经1 000转/min离心10 min，弃上清，收集细胞。加入表皮干细胞培养基（每100 ml KSFM培养基加入0.05 mmol氯化钙100 μl、HKGS添加剂1 ml）并轻柔吹打制成单细胞悬液，接种于预先铺有Ⅳ型胶原的培养瓶中，37℃孵育15 min。倒置镜下观察，粘附在Ⅳ型胶原被膜上的细胞为表皮干细胞，吸出细胞悬液，用DHank’s液洗2次，加入表皮干细胞培养基，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。2 d换液1次，显微镜下观察细胞生长，2～3 d内细胞开始分裂，4～5 d后会出现许多细胞克隆或集落。培养基中钙离子的浓度是保持人表皮干细胞既增殖又不分化的关键。钙离子浓度过低，会导致所培养的人表皮干细胞生长缓慢或不生长;若钙离子浓度过高，则加速了细胞分化。我们在实验中筛选出适合的培养基中钙离子浓度，可以保证有效的培养维持。在培养过程中，还要经常检查培养箱温度和CO2的浓度，过低或过高的温度和CO2含量都影响人表皮干细胞的生长，容易出现细胞老化和衰退现象。为了避免各种细菌、真菌污染培养箱，每周用75%的酒精擦洗箱内的托盘、格架、箱壁。托盘始终装有一定量的饱和浓度*（Na2HPO4）液体，细菌既不能在其中生长，也能提供合适的湿度[3]。
2 人表皮干细胞的传代
当原代细胞达到70%～80%融合时，需进行传代，否则细胞会没有足够的生长空间，也会因为营养耗竭而影响生长[4]。用0.25%*+0.02%EDTA消化培养瓶内细胞，置37℃温育5 min，必须经常在显微镜下观察细胞被消化的情况，若细胞部分漂浮起来，即可终止消化。加入2 ml终止液，用吸管反复轻轻吹打贴壁细胞，使其形成细胞悬液，按1∶2传代。传代细胞接种于IV型胶原预铺的培养瓶中。
尽管目前的药物和*有效干预了急性心肌梗死的发生和预后，但它的转归一直使我们束手无策。坏死的心肌无法再生，依靠纤维母细胞增生修复，形成的纤维瘢痕替代原心肌组织，功能丧失，zui终不可避免地发展为心力衰竭。现有的治疗手段有限，心脏移植又受到长期免疫抑制、感染机会多、供体来源不足、死亡率高等诸多因素的限制，干细胞移植越来越受到关注。
干细胞根据来源分为胚胎干细胞（ESCs）和成体干细胞。当受精卵分裂发育为囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。成体干细胞是指那些具有组织或器官特异性的干细胞，组织类型非常广泛，和心肌细胞有关有骨髓造血干细胞、外周血干细胞、脐血干细胞、骨髓间充质干细胞、骨骼肌卫星细胞（SCs）等。目前，研究zui多的用于治疗心肌梗死的干细胞有胚胎干细胞、骨骼肌卫星细胞和骨髓干细胞（Bone marrow stem cell，BMSc）。
在基础研究方面，可以说三者在技术方法、成果等各个方面均取得了重大突破。但由于前两者的某些缺陷，如ESCs的细胞来源困难及免疫抑制问题、SCs很难获得足够的细胞数量及移植后是否会形成异位兴奋点等在短期内不易解决，因此BMSczui被看好，且临床应用前景颇为乐观。现就骨髓干细胞移植的成果、进展着重阐述。
1 骨髓干细胞的分类及特点
混合骨髓的干细胞成分中除造血干细胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）外，还有骨髓基质中能分化为多种间质成分的干细胞―――间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）。MSCs主要来源骨髓，人们还从脐带血和外周血中及其它组织中分离得到MSCs。此外，骨髓干细胞的某些亚群在适当条件下可诱导分化为心肌细胞或内皮细胞。目前用于移植的自体骨髓干细胞主要包括:MSCs、骨髓单个核细胞（MNCs）、HSCs、内皮祖细胞、SP细胞、CD34+/-、Lin-c-kit pos 细胞等。
1.1 骨髓间充质干细胞 MSCs是各种间质细胞的前体细胞，具有很强的增殖能力和多向分化潜能。Liechty KW等将**MSCs移植入羊子宫后，发现MSCs原位特异性分化为骨骼、软骨、肌腱、骨骼基质、肌肉和心肌细胞 [1] 。MSCs尽管含量仅2～5个/10 6 单个核细胞，但可体外扩增十亿倍而不丧失干细胞活性。
2000年Wang JS等 [2] 观察到MSCs具有微环境依赖性分化，移植4周后开始表达肌球蛋白重链、收缩蛋白等成心肌细胞表型，形成缝隙连接，MSCs能够向心肌样细胞分化并可能替代宿主心肌细胞。Toma C等 [3] 也证实了人类MSC分化为心肌细胞的表型水平和与宿主心肌的水平相一致（如肌丝蛋白，β肌球蛋白重链、α肌动蛋白、肌动蛋白T、肌钙蛋白T、受磷蛋白）。Wang JS等 [4] 在2001进一步证实经冠脉循环移植的MSCs也能够定居心脏并分化为心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞三种细胞系。Shake J等 [5] 建立猪的心肌梗死模型后，将标记有Di-Ⅰ的自体骨髓间充质干细胞注射入梗死心肌，每周检测血液动力学和心功能，2周后可检测到心肌特异蛋白，4周后心收缩功能改善、室壁变薄减轻，免疫组化显示移植细胞移入并分化为心肌细胞。
研究表明，MSC分泌多种炎症细胞因子，如白介素-1和肿瘤坏死因子-α和生长因子，如碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子（VEGF）、angiopoietin-1 [6] ，在干细胞分化成心肌细胞及血管内皮中发挥积极作用。
1.2 骨髓造血干细胞 HSC除了具有重建受体造血与免疫功能外，在体外及体内经诱导可向非细胞系列分化。1999年证实造血干细胞可起到成心肌细胞和内皮祖细胞的作用。
2001年有两个研究小组报道了骨髓造血干/祖细胞在不同的条件下可分化为心肌细胞。他们将绿色荧光蛋白（GFP）阳性的转基因雄性小鼠Lin（-）c-kit + 和CD34 - /low c-kit + Sca-1 + 的骨髓造血干/祖细胞注射到梗死心肌附近。Orlic D等 [7，8] 在存活的受体小鼠梗死部位发现了带状新生细胞群，细胞中含多种心肌细胞特异蛋白，如肌球蛋白、转录因子GATA-4、连结蛋白43等。GFP + 和Y染色体阳性提示该新生细胞群是由移植的Lin（-）c-kit + 骨髓造血干/祖细胞分化生成。结果证实受损的心肌功能得到了部分恢复。Jackson KA [9] 等将CD34 - /low c-kit + Sca-1 + HSCs（所谓的SP细胞）移植给受致死性照射的小鼠，再行冠脉结扎60min后再通。结果发现，分化的心肌细胞首先出现在梗死区周围，约占总数的0.02%，并有LacZ和α肌动蛋白的表达而无FIT-1基因表达（FIT-1是内皮细胞的标志，在SP干细胞中缺乏），证明了HSCs的心肌再生潜能。
