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阅读:302发布时间:2014-6-6
当用纯化抗原进行选择时,评价所选择抗体的*方法是在高通量滴定模式下进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。虽然这也许与抗体zui终使用无关,但它提供了一个起始的筛选实验方案,能够让续后的分析集中在有希望的抗体上。大多数噬菌粒展示载体的设计容许进行两种ELISA模式:
一种是噬菌体ELISA,即用标记的抗噬菌体二抗试剂检测已结合的噬菌体;
另一种是可溶性scFv ELISA,即借助附在N端或C端上的表位标签来检测可溶性scFv。在这两种情况下,抗体表达都由lacZ启动子驱动。噬菌体展示取决于缺失葡萄糖时的渗漏表达,同时为了诱导可溶性抗体片段的表达,也需要使用IPTG。曾用来进行检测的标签包括:9E10、SV5以及FLAG。
总体上,尽管我们也发现一些抗体在噬菌体模式可以有信号,而在可溶性模式下却消失,但两种ELISA模式的结果是类似的。这也许是抗体发生了框移所致。当这些抗体展示在噬菌体表面时,会有大量的scFv被检测到;而当表达为可溶性scFv时则不行。这种情况正如前面在肽文库所描述的那样。大多数目前所使用的噬菌粒载体都容许从噬菌体结合性scFv简单切换到可溶性scFv。这要通过包括1个位于scFv基因和gⅢ之间的可抑制性琥珀密码子(TAG)来实现。在一个非抑制株(如HB2151)中,琥珀密码子被读作为终止子,因此,只有可溶性scFv生成。在一个非抑制株(如TGi、DHSaF’)中,TAG密码子读作*以及终止密码子,因此,可溶性scFv和scFv—pⅢ融合蛋白都将生成。也许理想的情况是,通过感染抑制株进行由噬菌体结合性scFv到可溶性scFv的转换,但实际上这并不必要。可溶性scFv的表达在抑制株内是很容易完成的,因此,抑制通常不过50%。粗制噬菌体或scFv样品就可适合于大多数的预分析试验。然而,如能简单地进行抗体纯化对于后续分析是有利的。是用包含六*标签的噬菌体载体,或者是将scFv基因亚克隆到一个将六*标签融合到scFvC末端的载体中。
不同轮次选择中,阳性克隆的比例将取决于抗体文库质量、抗原性质和物理选择过程,包括抗原密度、是否用可溶性或固相抗原以及洗涤严谨性。我们发现:按照免疫管选择程序,在第二轮后一般有10%~*的克隆是阳性的。尽早评估多样性,因为随着选择的进行,多样性会降低。这样就能提供一个更大容量的抗体文库,便于从中选择合适的抗体。
尽管结合性筛选方法是有用的,但这些常不将此法用于zui终的抗体选择。能够相对快速地生成大量抗体,可以容许建立一些除结合性方法之外的筛选方法。用于细胞内化、受体活化、配体拮抗、病毒灭活、诱导或抑制凋亡的各种选择方法,均可预期。而且,在某些情况下,例如内化,甚或可能直接选择具备这些功能的抗体。
采用ELISA时,噬菌体抗体可以在96孔微量滴定板中制备。将单个克隆挑人板孔中、培养并作为噬菌粒用辅助噬菌体进行救援。在微量板模式下噬菌体的生产效率不及更大体积的培养。这是因为不同克隆的生长率差异过大,结果有些克隆感染辅助噬菌体是在*OD值时,而其他克隆却是在OD值过高或过低时感染。这就导致了不同孔中噬菌体滴度差异很大。
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