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上海抚生实业有限公司
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阅读:163发布时间:2014-5-16
细胞因子mRNA表达的检测
常用的方法有Northern印迹杂交,斑点印迹杂交,RT-PCR,原位杂交与原位PCR,RNA半寿期的检测,进行中的转录分析(run。nassay)等。
(一)Northern印迹杂交
将RNA变性及电泳分离后,将其转移到固相支持物(如尼龙膜)上,再用某一细胞因子的标记核酸探针杂交,以检测相应细胞因子mRNA的分子量及其在细胞内的积累量。
细胞因子大都是在某种刺激因素的影响下,使其mRNA转录活性增强,从而导致细胞内mRNA积累增加。但用细胞总RNA作Northern印迹杂交,其结果不能*反映mRNA的转录活性,因为mRNA的稳定性及其降解速率直接影响细胞内mRNA的积累量。
(二)斑点及狭缝印迹杂交
原理同上。只是用RNA替代DNA点样在膜上,其变性方法与DNA不同。
(三)反转录PCR(RT-PCR)
细胞因子的mRNA寿命短且拷贝数低,因此难以在小量样本中进行检测。RT-PCR是一种能检测细胞内低丰度特异RNA的方法,其原理是首先以RNA为模板,在逆转录酶的催化下,合成与RNA互补的cDNA。然后以cDNA为模板,用PCR技术对靶序列进行扩增,使微量细胞因子的RNA经放大后检出。RT-PCR能检出单个细胞中少于10个拷贝的特异RNA,如同时放大内参照物,即可对RT-PCR检出的细胞因子mRNA进行定量。
(四)原位杂交及原位RT-PCR
原位杂交的原理基本同上,仅是在组织细胞切片上,用标记的核酸探针检测胞浆内的特异mRNA;而检测细胞内低拷贝mRNA的方法则用原位反转录PCR。
(五)mRNA半寿期的测定
mRNA半寿期的长短直接影响细胞内mRNA的积累量。其测定原理是利用*(10ug/mL)可阻断新的mRNA的转录,在转录停止后的不同时间提取总RNA,通过Northem印迹杂交及扫描定量,确定阻断前已转录的mRNA随着时间迁移的衰减程度,以mRNA降解到原有mRNA的50%所需要的时间为该mRNA的半寿期。
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