ELISA试剂盒中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA试剂盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。
加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保 证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。
在ELISA试剂盒中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育（incubation），有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。
ELISA属固相，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散
才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立elisa方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，ELISA试剂盒产物的生成可达。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为*，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中，以形成多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。
