1.样品稀释
酶联免疫反响是一种敏感性很高的反响，如果血清不稀释，不行避免会发生很强的非特异性反响，出现假阳性。因而，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至恰当的倍数，以下降非特异性反响，使特异性的抗原抗体反响充沛体现出来。
2.试剂盒平衡
试剂盒中一切试剂和板条均应在实验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20-30分钟以上。平衡时刻太短会形成试剂混匀不够，样品孵育时刻相对缩短，ELISA反响不够充沛。冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。
3.样品和试剂的混匀
稀释前、后的样品有必要充沛混匀，一切试剂在加样前也须摇匀，以保证实验的均一性。
4.加样
在现在的ELISA商品试剂盒中，必定有运用微量加样器加入样本的步骤。注意的要害点是：加样不行太快，要避免加在孔壁上部，不行溅起和发生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。溅起会对邻近孔发生污染。出现气泡则反响液界面有差异。所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。
5.温育
温育是ELISA测定中影响测定胜败为要害的一个要素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反响在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原*结合，有必要在必定的温度条件下反响必定的时刻。温育所需时刻与温度成反比，即温度越高，则所需时刻相对较短。
