ELISA检测试剂盒中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA试剂盒板孔的底部，
避免加在孔壁上部，并注意不行溅起，不行产生气泡。
加标本一般用微量加样器，按规定的量参加板孔中。每次加标本应更换吸嘴，避免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。
有此测定（如间接法 ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中参加稀释液，再在其间参加血清标本，
然后在微型震动器上震动1分钟以保 证混和。加酶结合物使用液和底物使用液时可用定量多道加液器，使加液进程敏捷完结。
在ELISA检测试剂盒中一般有两次抗原抗体反响，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反响的完结需求有必定的温度和时刻，
这一保温进程称为温育（incubation），有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。
ELISA属固相，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，参加板孔中的标本，
其间的抗原并不是都有平等的和固相抗结合的时机，只有靠近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐渐平衡的进程，因而需经扩散
才干达到反响的终点。在其后参加的酶符号抗体与固相抗原的结合也相同如此。这便是为什么ELISA反响总是需求必定时刻的温育。
温育常选用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是试验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的适宜温度。
在建立ELISA办法作反响动力学研究时，试验表明，两次抗原抗体反响一般在37℃经1-2小时，ELISA检测试剂盒产品的生成可达高峰。
为加快反响，可进步反响的温度，有些试验在43℃进行，但不宜选用更高的温度。抗原抗体反响4℃更为*，在放射免疫测定中多使反响在冰箱中，
以构成多的沉积。但因所需时刻太长，在ELISA试剂盒中一般不予选用。
