ＢＭＳＣｓ／ＰＲＦ复合载蛇床子素支架材料修复兔下颌骨缺损的实验研究
郭延伟 李松 房殿吉＊
（佳木斯大学附属口腔医院颌面外科 黑龙江  佳木斯    １５４０００）
 

［摘要］ 目的：探讨 ＢＭＳＣｓ／ＰＲＦ 复合载蛇床子素支架材料修复兔下颌骨缺损的实验研究的可行性。方法：３６ 只新西兰大白兔随机分为３组，每组１２只，双侧下颌骨制备缺损模型。Ａ 组植入 ＢＭＳＣｓ／ＰＲＦ 复合载蛇床子素支架材料；Ｂ 组植入 ＢＭＳＣｓ复合载蛇床子素支架材料，Ｃ 组单植入纳米羟基磷灰石支架材料。分别于术后２、４、８、１２ 周处死实验动物，制备组织标本，行大体观察、影像学分析、ＨＥ 染色、扫描电镜检测，并对影像学分析值及成骨情况加以评价，对分析数据结果使用ＳＰＳＳ１７．０统计软件进行分析，Ｐ ＜０．０５ 有统计意义。结果：影像学检查及组织学染

色显示 Ａ 组骨缺损处愈合程度，成骨速度及其质量明显优于 Ｂ组Ｃ 组；扫描电镜显示 Ａ 组该复合材料与组织相容
性好，无炎症刺激反应；统计牙 ＣＴ 分析数据及新生骨面积，Ａ 组的成骨情况明显优于Ｂ 组与Ｃ 组（Ｐ ＜０．０５）。结论：ＢＭＳＣｓ／ＰＲＦ 复合载蛇床子素支架材料有明显骨诱导作用，是一种新型复合材料，可望成为临床应用中修复颌骨缺损的新型材料。
［关键词］ 骨  颌骨缺损  骨髓间充质干细胞 ＢＭＳＣｓ   富血小板纤维蛋白 ＰＲＦ   蛇床子素 Ｏｓｔｈｏｌ
［中图分类号］ Ｒ７８２．４ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １６７１—７６５１（２０１２）１１—１０８７—０５
ＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＢＭＳＣｓ／ＰＲＦＣｏｍｐｏｕｎｄｗｉｔｈｔｈｅＯｓｔｈｏｌＳｃａｆｆｏｌｄｓｆｏｒＲｅｐａｉｒｔｈｅＭａｎｄｉｂｕｌａｒＤｅｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅＲａｂｂｉｔ．ＧＵＯ Ｙａｎ－ｗｅｉ，ＬＩＳｏｎｇ，ＦＡＮＧ Ｄｉａｎ－ｊｉ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒａｌａｎｄ ＭａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｔｏｍａｔｏ－ ｌｏｇｉｃａｌ，ＪｉａｍｕｓｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉａｍｕｓｉ１５４００４
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅＢＭＳＣｓ／ＰＲＦｃｏｍｐｏｕｎｄ ｗｉｔｈｔｈｅＯｓｔｈｏｌｓｃａｆｆｏｌｄｓｆｏｒ
ｒｅｐａｉｒｔｈｅｍａｎｄｉｂｕｌａｒｄｅｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｒａｂｂｉｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：３６ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｗｈｉｔｅｒａｂｂｉｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ３ ｇｒｏｕｐｓ．Ｂｉｌａｔｅｒａｌｍａｎｄｉｂｕｌａｒｄｅｆｅｃｔｍｏｄｅｌｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄ．Ａ：ｇｒｏｕｐｏｆｉｍｐｌａｎｔｅｄ ＭＳＣｓ／ＰＲＦｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓ Ｏｓｔｈｏｌ；Ｂ：ｇｒｏｕｐｉｍｐｌａｎｔｅｄＢＭＳＣｓｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＯｓｔｈｏｌ，Ｃ：ｇｒｏｕｐｏｆｓｉｎｇｌｅｎａｎｏ－ｈｙｄｒｏｘｙａｐａ－ ｔｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓｉｍｐｌａｎｔｅｄ．Ａｌｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｉｍａｌｓｗｅｒｅｓａｃｒｉｆｉｃｅｄａｆｔｅｒ２，４，８，１２ ｗｅｅｋｓｔｏｐｒｅｐａｒｅｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓ． Ｔｈｅｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｉｎｇｅｎｅｒａｌａｎｄｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ．ＨＥｄｙｅｉｎｇ，ＳＥＭ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ，ａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆ ｔｈｅｖａｌｕｅｏｆｔｈｅＩｍａｇｉｎｇａｎｄｔｈｅｂｏｎｅｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｉｎｖｉｖｏｉｍａｇｉｎｇａｎｄｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔｂｏｎｅｄｅｆｅｃｔｂｏｎｅｑｕａｌｉｔｙｏｆａｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓ．ＳＥＭ ｓｈｏｗｅｄｔｈｅｗｅｌｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｍａｔｅｒｉａｌａｎｄｔｉｓｓｕｅｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ，ｎｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ＢｙｍｅａｓｕｒｉｎｇａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅｄｅｎｔａｌＣＴｄａ－ ｔａａｎｄｎｅｗｂｏｎｅａｒｅａ，ｔｈｅＡｇｒｏｕｐｂｏｎｅｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈｅｏｔｈｅｒｇｒｏｕｐｓ （Ｐ ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ ＢＭＳＣｓ／ＰＲＦｃｏｍｐｏｕｎｄｗｉｔｈｔｈｅＯｓｔｈｏｌｓｃａｆｆｏｌｄｓｆｏｒｒｅｐａｉｒｔｈｅｍａｎｄｉｂｕｌａｒｄｅｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｒａｂｂｉｔｈａｓｏｂｖｉｏｕｓｉｎｄｕｃ－ ｔｉｏｎｏｆｂｏｎｅ．Ｉｔｉｓａｎｅｗｃｏｍｐｏｓｉｔｅｍａｔｅｒｉａｌ，ｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｂｅｃｏｍｅｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｗ ｍａｔｅｒｉａｌｓｔｏｒｅｐａｉｒ ｔｈｅｍａｎｄｉｂｕｌａｒｄｅｆｅｃｔｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］  Ｂｏｎｅ   ＭａｎｄｉｂｕｌａｒＤｅｆｅｃｔｓ  ＢＭＳＣｓ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈｆｉｂｒｉｎ（ＰＲＦ）  Ｏｓｔｈｏｌ

下颌骨功能结构复杂，而造成其缺损的原因也很多，若不及时进行修复或修复不当，则常常会造成骨不连或延迟愈合等严重后果。随着当代组织工程学及分子生物学的迅猛发展，利用干细胞作为种子细胞复合支架材料修复骨缺损成为近年来研究的热
基金项目  国家自然科学基金（编号：８１１７０９３５）
作者简介   郭延伟（１９８５～  ），男，山东聊城人，硕士，主要从事口腔颌面外科的研究工作。
＊ 通讯作者  房殿吉，dian话：０４５４－８６２５５８１
点，骨髓间充质干细胞（ＢＭ－ ＭＳＣｓ）以其多项分化的潜能及自身所具有的遗传背景稳定和对机体无免
疫排斥反应等优点成为理想的种子细胞［１～３］。ＰＲＦ是继富血小板血浆（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｒｉｃｈｐｌａｓｍａ，ＰＲＰ）后第２代血小板浓缩液，以血小板凝胶形式呈现，其所
内含的高浓度的生长因子能促进骨组织和软组织再生修复，单独或联合其他生物材料注人硬组织缺损或软组织创伤处，可以修补缺损，诱导生长，加速局部创伤的愈合并提高愈合质量［４～６］。实验证明，蛇


床子素 可 促 进 大 鼠 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 （ＢＭ － ＭＳＣｓ）的增殖及向成骨细胞分化并抑制其向脂肪细胞分化，而且蛇床子素具有促进成骨细胞增殖的
能力［７，８］。本研究将骨髓间充质干细胞作为种子细胞，以载蛇床子素的羟基磷灰石为支架材料，结合
ＰＲＦ 中多种生长因子及其诱导并促进成骨修复兔下颌骨缺损，为临床应用提供了理论依据。
１ 材料与方法
１．１   实验动物  健康新西兰大白兔３６ 只，体重２．
０～３．０ｋｇ，３～６月龄，雌雄不限，（由佳木斯大学动物实验中心提供），材料及仪器：医用纳米级羟基磷
灰石（上海源叶生物科技有限公司），蛇床子素（上海恒远生物科技有限公司），离心机，ＪＳＭ －６３６０ＬＶ扫描电镜，倒置相差显微镜，牙 ＣＴ。
１．１．１   骨髓间充质干细胞的获取及培养   无菌条
件下，骨髓穿刺针兔双侧股骨大转子处抽取骨髓３
～５ ｍＬ，然后加入 ２０ ｍＬ 的 ＤＭＥＭ 培养液中混匀，过滤杂质后以１５００ｒ／ｍｉｎ 离心２０ ｍｉｎ，离心完后取上层骨髓，加入５ ｍＬ 制成 ＤＭＥＭ 培养液制成单细胞悬液（细胞数为１０ 个／ｍＬ），然后置入容积为 ３０ ｍＬ 的培养瓶中，加入１０ｍＬ 含２０％新生小牛血清、青霉 素 １００ Ｕ／ｍＬ、硫 酸链霉素 １００ｇ／ｍＬ 的 ＤＭＥＭ 培养液，再次离心１２００ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，去上清，计数。然后置入３７ ℃、５％ＣＯ２  培养箱内培养。细胞培养２４ｈ贴壁，呈梭形成纤维样细胞生长，７２ｈ后大量细胞成纤维样生长，部分区域成漩涡样细胞群，见图１。在细胞种植的第４ 天第１ 次换液，以后每２ｄ换液１ 次，细胞生长７～１０ｄ 后长满瓶底面积的８０％时２．５％胰蛋白酶收集计数并传代。

图１   ＢＭ－ＭＳＣｓ倒置显微镜（×２００） 图２   ＰＲＦ 膜状结构
Ｆｉｇ．１  Ｉｎｖｅｒｔｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｆｉｇ．２   ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＰＲＦｆｉｌｍ ｏｆＢＭ－ＭＳＣｓ
１．１．２   富血小板纤维蛋白（ＰＲＦ）制备   自兔耳缘静脉抽取血液８ ｍＬ 收集到不添加抗凝剂的无菌试管中迅速离心，１２００ｒ／ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ，即分为３层，中间层即为ＰＲＦ，用无菌纱布挤压 ＰＲＦ，使其成为膜状结构，眼科剪剪成碎片植入普通培养液备用，
见图２。
１．１．３   载蛇床子素－ＮＡ 支架材料模型的制备
蛇床子素与羟基磷灰石按１∶１ 比例置入直径：１．０ ｃｍ，厚：０．３ｃｍ 模具中，成 型稳定，称 重 （２１±１） ｍｇ，制备２４颗，待用。
１．１．４   细胞载体复合物的制备   培养第３ 代 ＢＭ－ ＳＣｓ制成细胞悬液浓度２×１０ 个／ｍＬ 接种于载蛇床子素与 ＮＡ 支架材料（１∶１）上，然后培养箱中培养２４ｈ，更好的使ＢＭＳＣｓ进入支架材料孔隙中。

图３ Ａ、Ｂ、Ｃ３组 Ｘ 线４周
Ｆｉｇ．３   Ｘ－ｒａｙｏｆＡ，Ｂ，Ｃｇｒｏｕｐｓａｆｔｅｒ４ｗ
图４   Ａ、Ｂ、Ｃ３组 Ｘ 线 １２周
Ｆｉｇ．４   Ｘ－ｒａｙｏｆＡ，Ｂ，Ｃｇｒｏｕｐｓａｆｔｅｒ１２ｗ
１．２   手术分组及试验方法
１．２．１   手术分组  ３６ 只新西兰大白兔随机分为３组，每组１２只，制备双侧下颌骨缺损模型，Ａ 组植入 ＢＭＳＣｓ／ＰＲＦ 复合载蛇床子素支架材料；Ｂ 组植入 ＢＭＳＣｓ复合载蛇床子素支架材料，Ｃ 组单植入羟支架材料。
１．２．２   试验方法  取兔称重后，２０％乌拉坦（５ ｍｌ／ ｋｇ）耳缘静脉注射麻醉。麻醉显效后常规术区备皮消毒铺巾后沿左侧下颌骨下缘做平行切口，长度３
～４ｃｍ，分层切开皮肤皮下组织，暴露下颌骨下缘及颊面，而后用裂钻于下颌骨体颊侧中下处制备骨
缺损，直径１．２ｃｍ，深度０．３ｃｍ。按手术分组植入不同材料。手术中生理盐水降温，右侧同上。充填完毕，分层严密缝合切口，分笼饲养。术后肌注庆大
霉素预防感染，剂量为２万 Ｕ／次，２次／ｄ，持续５ｄ。
１．３   观察指标
１．３．１   大体观察  观察骨缺损区表面情况及新骨形成情况及探测骨表面硬度。
１．３．２   影像学分析  Ｘ 线观察骨缺损区密度影的改变及材料与周围组织接触情况。牙 ＣＴ 扫描骨缺损区内６个不同位点，并记录 ＣＴ 值，取均值并进行统计分析。
１．３．３   组织学观察   于骨缺损区周围０．５ ｍｍ 处取材，４％多聚甲醛固定２４ｈ后脱钙处理，常规标本


浸蜡，包埋，切片，ＨＥ 染色，光镜观察。
１．３．４   扫描电镜观察 将组织块置于４％ 戊二醛固定液２４ｈ取出，ＰＢＳ液冲洗３次，梯度乙醇脱水，醋酸异钨酯中置换１５ ｍｉｎ，ＪＳＭ－６３６０ＬＶ 扫描电镜检测材料与周围组织密合情况及生物相容性。
１．３．５   计算机图像分析   术后４ 个时间段所有组织连续切片，并进行系统选片，每块组织选５ 张，光镜１００倍下每张切片系统随机选取６ 个视野，在图像分析仪下进行组织学形态分析，测定术后各个时
间点上新生骨小梁面积所占修复区面积的比值。
表１ 各时间段３组骨缺损区 ＣＴ 值测定比较分析
Ｔａｂｌｅ１    ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＣＴ ｖａｌｕｅｓ ｍｅａｓｕｒｅｄｆｏｒｔｗｏ
±ｓ 表示，组间、组内差异比较采用ｔ 检验分析，Ｐ ＜
０．０５ 为差异有显著性意义，见表１、表２。
表２ 各时间段两组新生骨占骨缺损面积的百分比
Ｔａｂｌｅ２   Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｔｈｅｎｅｗｂｏｎｅａｒｅａｏｆｔｏｔａｌｂｏｎｅｄｅｆｅｃｔｓ
ｘ珚±ｓ
组别       ２周         ４周         ８周         １２周
Ａ 组  ３９．５０±２．５２ ４３．２５±１．７１ ５１．５０±１．３０ ６２．２５±３．７６ Ｂ组   ２２．００±２．３４３０．１５ ±３．５１４１．００ ±３．３１４７．４５±２．１３ Ｃ组   １３．００±１．８３ ２５．００±２．１６ ３１．２５±１．２６ ３６．５０±３．４２
注：与对照组比较，Ｐ＜０．０５
２ 结 果
２．１   大体观察  ２ 周时，Ａ 组材料小部分吸收，界
ｂｏｎｅｄｅｆｅｃｔｓ
ｘ珚±ｓ
清，其余两组缺损区有纤维状组织包裹，Ｃ 组多见炎
性渗出，３组探测质地均较软；４周时，Ａ 组材料吸收明显，缺损边缘与周边骨结合较牢固，探测质地较
Ｂ组   －３３２±２７．７９－１２１±１１．６２ ２２±１０．３１   １１５±１３．２３
    Ｃ组   －４０２±２２．３７－１８２±２６．９９ －１８±８．０４   ４８±１２．６８ 
注：与对照组比较，Ｐ＜０．０５
１．３．６   统计学方法 使用 ＳＰＳＳ１７．０ 统计软件对
ＣＴ  值及新生骨小梁面积进行统计分析。数据以 ｘ珚
硬，Ｂ 组，Ｃ 组纤维组织充填较多，质地软；８ 周时，Ａ组材料大部吸收，缺损区与周围骨无明显差异，硬度明显增加，Ｂ 组残存材料较多，硬度不及实验组；１２
周时，Ａ 组缺损区骨膜包被，硬度与周围骨相当，Ｂ
组，Ｃ 组表面仍有纤维组织，硬度不明显。







图５   Ａ 组扫描电镜１２周 图６   Ｂ组１２周 图７   Ｃ组１２周
Ｆｉｇ．５   ＳＥＭ ｏｆＡｇｒｏｕｐａｆｔｅｒ１２ｗ Ｆｉｇ．６   ＳＥＭ ｏｆＢｇｒｏｕｐａｆｔｅｒ１２ｗ Ｆｉｇ．７   ＳＥＭ ｏｆＣｇｒｏｕｐａｆｔｅｒ１２ｗ

图８   Ａ 组苏木精－ 伊红染色（×２００）１２周 图９   Ｂ组苏木精－ 伊红染色（×２００）１２周 图１０   Ｃ组苏木精－ 伊红染色（×２００）１２周
Ｆｉｇ．８   ＨＥｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＡｇｒｏｕｐａｆｔｅｒ１２ｗ Ｆｉｇ．９   ＨＥｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＢｇｒｏｕｐａｆｔｅｒ８ｗ Ｆｉｇ．１０   ＨＥｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＣｇｒｏｕｐａｆｔｅｒ１２ｗ

２．２  Ｘ 线检测  ２ 周时，３ 组缺损区内低密度影明显，有材料阻射影，与周围骨组织界清；４ 周时，Ａ 组可见絮状高密度影，材料可见吸收，硬度增加，与周
围正常骨边界尚清，Ｂ、Ｃ 组缺损区材料阻射影依旧
清楚，低密度影多，与周围界限清；８ 周时，Ａ 组区域可见均匀骨痂影像，有骨性连接，骨密度增加，与周围界限不清，Ｂ 组缺损区可见絮状高密度影，骨密度
较低，与周围界限尚清，Ｃ 组低密度影明显

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