酶联免疫吸附测定肿瘤坏死因子试剂盒操作中标本的收集

    用于ELISA测定的临床标本zui为常用的是血清(浆)，有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前使用血清(浆)标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和治疗药物等。

    对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨4：00—6：00之间，会有一峰值出现；生长激素、促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。

    又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的zui适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响。

ELISA试剂盒操作步骤：

方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法

1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。

2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。

4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。

5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+"、“-"号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二　用于检测未知抗体的间接法

1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜；

2.次日洗涤3次；

3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤；

4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml；

5.37℃孵育30-60分钟，洗涤；

6.’zui后一遍用DDW洗涤。

其余步骤同“双抗体夹心法"的4、5、6。

试剂

（1）　包被缓冲液（PH9.60.05M碳酸盐缓冲液）:

Na2CO3 1.59克

NaHCO3　2.93克

加蒸馏水至1000ml

（2）　洗涤缓冲液（PH7.4PBS）：0.15M

KH2PO4 0.2克

Na2HPO4·12H2O　2.9克

NaCl　8.0克

KCl　0.2克

Tween-20　0.05%　0.5ml

加蒸馏水至1000ml

（3）　稀释液：

牛血清白蛋白（BSA） 0.1克

加洗涤缓冲液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10%使用。

（4）　终止液（2M　H2SO4）：

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸（98%）21.7ml。

（5）　底物缓冲液（PH5.0磷酸枣柠檬酸）:

0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml

0.1M柠檬酸（19.2克/L）　24.3ml

加蒸馏水50ml。

（6）　TMB（四甲基联苯胺）使用液:

TMB（10mg/5ml无水乙醇）0.5ml

底物缓冲液（PH5.5）　10ml

0.75%H2O2　32μl

（7）　ABTS使用液:

ABTS　0.5mg

底物缓冲液（PH5.5）　1ml

3%H2O2　2μl

（8）　抗原、抗体和酶标记抗体。

（9）　正常人血清和阳性对照血清。

器材

（1）　聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50μl及100μl加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。

（2）　小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。

（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。

实验条件的选择

在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:

（1）　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。

（2） 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的zui适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值zui大而蛋白量zui少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。

（3）　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法"（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。

（4）　酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体（如OPD等）有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配制，尤其是H2O2在临用前加入。

自备材料

1． 蒸馏水。

2． 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3． 振荡器及磁力搅拌器等。

安全性

1． 避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

2． 实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

3． 不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

肿瘤坏死因子试剂盒操作注意事项

1． 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

2． 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

3． 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

4． 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

5． 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

6． 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

7． 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

8． 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

9． 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

    Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎（HEV）病毒 IgM 抗体ELISA检测。

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