ELISA方法检测抗原抗体分类

 ELISA技术可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：
（1）固相化的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；

（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；

（3）酶反应的底物。

    根据试剂的来源和样本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。以下主要介绍几种公司常用的检测抗原的类型：

1、间接竞争法测抗原
　　样本中的待测药物和固相化的抗原共同竞争一定量的抗体，加入酶标记抗抗体（酶标二抗）后能与固相化的抗原抗体复合物特异性结合，经底物显色后检测，样本中药物含量愈高，竞争结合的抗体量愈多，从而结合在固相上的酶标记抗抗体（酶标二抗）量愈少，zui后的显色也愈浅。本公司及国内产品多用此法。具体操作步骤如下：

1）抗原固相化：将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

2）加入标准品/样本，再加入抗体，保温反应。样本中药物与固相抗原同时竞争与特异性抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去游离物质及吸附在固相载体上结合不紧密的物质。
3）加酶标抗抗体，固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与样本中受检药物的量负相关。
4）加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析，测知样本中抗原的量。

2、直接竞争法测抗原
　　（1）直接竞争酶标抗原法测抗原

   样本中的待测药物和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，经底物显色后检测，样本中药物含量愈高，结合在固相上的酶标抗原量愈少，zui后的显色也愈浅。

（2）直接竞争酶标抗体法测抗原

样本中的待测药物和固相抗原竞争结合一定量的酶标记抗体，经底物显色后检测，样本中药物含量愈高，结合在固相上的酶标抗体愈少，zui后显色也愈浅。

    直接竞争法具体操作步骤如下：

1）抗原（或抗体）的固相化：将特异性抗原（或抗体）与固相载体联结，形成固相抗原（或抗体），洗涤除去未结合的抗原（或抗体）及杂质。

2）加入标准品/样本，再加入酶标抗体（或酶标抗原），保温反应。样本中药物与固相抗原（或酶标抗原）同时竞争与特异性抗体（或固相抗体）结合，形成固相抗原-酶标抗体复合物（或抗体-酶标抗原复合物）。洗涤除去游离物质及吸附在固相载体上结合不紧密的物质。
3）加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析，测知样本中抗原的量。

本公司目前正致力于研究酶标记抗原和酶标记抗体直接竞争法测定抗原，国外大部分ELISA试剂盒均采用此类型。

3、双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原zui常用的方法，操作步骤如下：
1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2） 加受检样本，保温反应，样本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去其他未结合物质。
3） 加酶标抗体，保温反应，固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，*洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4） 加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析，测知样本中抗原的量。
　　在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检样本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。
　　在一步法测定中，当样本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定样本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的zui高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
　　假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可
用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型
问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应
性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
　　双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。
　　双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。