ELISA抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量

【基本原理】

本法是用纯化或重组的IL-2R（α链，P55，CD25，Tac抗原）蛋白包被96孔酶标反应板，同时加入已知量的抗IL-2RMcAb，再分别加入sIL-2R标准品与待测样品。则待测sIL-2R或者sIL-2R标准品与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白竞争与抗IL-2R McAb结合。通过与标准品对照，从抗IL-2R McAb与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白结合受抑制程度来求得待测样品中sIL-2R含量。

【材料和试剂】

（1）         纯化或重组的IL-2R蛋白（α链，P55，CD25，Tac抗原）（40.000u/ml）

（2）         FITC标记的抗IL-2R McAb（0.2μg/ml）：FITC为异硫氰酸荧光素，这里仅作为半抗原使用，而不作为荧光素标记。

（3）         碱性磷酸酶标记的兔抗FITC抗体（酶标抗体）

（4）         对硝基苯磷酶盐底物液；用pH9.8的二乙醇胺缓冲液溶解，配成浓度为1mg/ml。

（5）         1%牛血清白蛋白-PBS（1%BSA-PBS）：为封闭液点稀释液

（6）         不同倍比稀释度的sIL-2R标准品：以1% BSA-PBS稀释。

（7）         洗涤液（0.05%Tween20-PBS）

（8）         待测sIL-2R样品

（9）         96孔酶标板（聚苯乙烯板），酶标仪，波长465nm滤光片

（10）      刻度吸管，毛细吸管，加样器（头），4℃冰箱

【操作步骤】

（1）         以一定浓度的纯化或重组的IL-2R（P55）蛋白包被96孔酶标板，100ul/孔，4℃过夜（16-72h）；

（2）         弃包被液，用1%BSA-PBS封闭非特异性结合位点，200ul/孔，置室温2h；

（3）         用洗涤液加满各孔置3min，然后倾去，反复洗涤3次；

（4）         分别加入不同稀释度的sIL-2R标准品及待测样品，50μl/孔；

（5）         各孔均加入FITC标记的IL-2R McAb，50μl/孔，充分混匀后置室温2h；

（6）         同上洗涤3次；

（7）         各孔均加入碱性磷酶酶标记的兔抗FITC抗体，100μl/孔，置室温1h；

（8）         同上洗涤3次；

（9）         各孔均加入底物液，100μl/孔，置室温15-30min；

（10）      用酶标仪以波长405nm测各孔OD值。

【结果分析】

（1）         以sIL-2R标准品各稀释度对应的浓度值为横座标（X），相应的OD值为纵座标（Y），在普通座标纸上绘制竞争抑制标准曲线，OD值随标准品sIL-2R浓度升高而降低。

（2）         根据待测样品所测得的OD值，在标准曲线上查得样品sIL-2R含量。

（3）         本方法测定sIL-2R含量时，不需要计算抑制百分率。

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