白藜芦醇与伊马替尼协同作用对 Ｋ５６２
细胞生物学行为的影响＊
王晓军１ 茹甫毅１ 吴双有１ 朱卫民１ 田培军１

［摘要］ 目的：探讨白藜芦醇对人白血病细胞增殖的影响及机制。方法：采用不同浓度白藜芦醇及伊马替尼对 Ｋ５６２细胞进行干预，通过 ＭＴＴ法、台盼蓝染色观察细胞增殖，ｃａｓｐａｓｅ－３活 性 检 测、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染 色 及 流式细胞术观察细胞凋亡情况和细胞增殖抑制率，利用中效原理计算出各时间段内白藜芦醇、伊马替尼对 Ｋ５６２细胞增殖抑制的中效浓度，以检测二者有无联合增效作用。结果：不同剂量白藜芦醇、伊马替尼单独作用和联合作用对 Ｋ５６２细胞均有生长抑制作用，在一定范围内呈剂量、时间依赖性，２种药物联合有协同增效作用。随着白藜芦醇或伊马替尼浓度升高，其ｃａｓｐａｓｅ－３活性逐渐增强。白藜芦醇、伊马替尼单独作用和联合作用对人白血病细胞 Ｋ５６２均 有 凋 亡 作 用，且联合用药组随着白藜芦醇或伊马替尼浓度的增加，Ｋ５６２细胞的凋亡率也逐渐增 加。
结论：白藜芦醇及伊马替尼对白血病 Ｋ５６２细胞株均有促进凋亡作用，联合用药可明显增加其凋亡率。
［关键词］ 白血病；白藜芦醇；伊马替尼；凋亡白藜芦醇本质是一种活性非黄酮多酚化合物的新型抗癌 剂，近年研究发现白藜芦醇对ru腺癌、前列腺癌、皮肤癌等多种肿瘤细胞的生长均具有显著的抑制作用，同时也对人白血病细胞具有明显抑制生长作用，是非常有前景的天然抗肿瘤药物。但是其抑制肿瘤细胞生长的具体机制比较复杂，文献＊ 基金项目：陕西省卫生科研项目（Ｎｏ：Ｄ８０） １安康市中心医院（陕西安康，７２５０００）通信作者：茹甫毅，Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｙａｎｆｏｒｅ＠１２６．ｃｏｍ报道较少。为了解白藜芦醇在抗白血病中的作用，我们观察了白藜芦醇对人白血病细胞 Ｋ５６２生长的影响。现将结果报告如下。

１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 细胞株 人白血病 Ｋ５６２细胞株购自南京科佰生物科技有限公司。
１．１．２ 细胞培养液 本实验所用 ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养 液 含 有 １０％ 灭 活 胎 牛 血 清，１００ Ｕ／ｍＬ 青 霉素，１００Ｕ／ｍＬ链霉素。· ５０７ ·临床血液学杂志 第３０卷
１．１．３ 主要试剂 ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养液购自美国 Ｇｉｂｃｏ公司；台盼蓝购自上海恒远生物科技有限公司；ＭＴＴ 检 测 试 剂 盒 购 自 Ａｍｒｅｓｃｏ公 司；白 藜芦醇购自西安奥特斯生物制品有限公司；伊马替尼（瑞士 ＮＯＶＡＲＴＩＳ公司）；ｃａｓｐａｓｅ－３活性检测试剂
盒购自 Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司。
１．２ 方法
１．２．１ 实验分组 将 Ｋ５６２细胞株分为空白对照组、伊马替尼单药组（０．１、０．２μｍｏｌ／Ｌ）、白藜芦 醇单药组（５０、１００、２００μｍｏｌ／Ｌ）、伊马替尼联合白 藜芦醇 组 （伊 马 替 尼 ０．１ μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 芦 醇 ５０μｍｏｌ／Ｌ、伊 马 替 尼 ０．１μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 芦 醇 １００μｍｏｌ／Ｌ、伊 马 替 尼 ０．１μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 芦 醇 ２００μｍｏｌ／Ｌ、伊 马 替 尼 ０．２ μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 芦 醇 ５０μｍｏｌ／Ｌ、伊 马 替 尼 ０．２μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 芦 醇 １００μｍｏｌ／Ｌ、伊 马 替 尼 ０．２μｍｏｌ／Ｌ＋ 白 藜 芦 醇 ２００μｍｏｌ／Ｌ）。上述每组细胞均设置６个复孔。１．２．２ 药品制备 白藜芦醇及伊马替尼片剂分别采用二甲基亚砜进行溶解，按浓度为１０ｍｇ／ｍｌ配制原液，在生理盐水稀释，稀释浓度为２０μｍｏｌ／Ｌ。另外２５０ｍｇ的 ＭＴＴ 粉剂溶于５０ｍｌｐＨ 为７．４的 ＰＢＳ液 中。所 有 液 体 均 过 滤 分 装，保 存 条 件 为－２０℃。
１．２．３ 细胞培养 将 Ｋ５６２细胞培养在含１０％胎牛血清、１００ Ｕ／ｍＬ 青 霉 素、１００ｐｇ／ｍＬ 链 霉 素 和２ｍｍｏｌ／Ｌ谷 氨 酰 胺 的 ＲＰＭｌ－１６４０ 培 养 液 内，于３７５％ＣＯ２ 饱 和 湿 度 条 件 下 培 养，每２～３ｄ传代１次。细胞处于对数生长期时用于实验。１．２．４ ＭＴＴ 法检 测 细 胞 增 殖 收集对数生长期的 Ｋ５６２细胞于３７℃、５％ＣＯ２ 细胞培养箱中培养，分别于２４、４８、７２ｈ时加入２０μｌＭＴＴ 溶液（５ｍｇ／ｍｌ），继续于３７℃、５％ＣＯ２ 培养箱中孵育４ｈ，随后弃掉 细 胞 培 养 液；向 每 个 细 胞 培 养 孔 中 分 别 加 入１５０μｌＤＭＳＯ，用脱色摇床振荡１０ｍｉｎ，随后用酶联免疫检测仪，使结晶物充分溶解；选择５７０ｎｍ 波长（Ａ５７０），以空白孔调零，于酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度并记录结果，计算细胞增殖抑制率，公式为：细胞增殖抑制率＝１－实验孔Ａ５７０／对照孔Ａ５７０。１．２．５ 台盼蓝拒染实验 按照１．２．１中的分组将相应药物加 入 至 各 组 细 胞 培 养 孔 中，作 用４８ｈ后用移液器吹打细胞使之制成单细胞悬液；将各组细胞悬液作适当稀释后用台盼蓝进行染色，具体操作为细胞悬液与０．４％台盼蓝溶液按照９∶１比例混合均匀，随后在３ｍｉｎ内用细胞计数板统计活细胞数和死细胞数；选择各组作用的zui佳浓 度，分 别 用该浓度作用于 Ｋ５６２细胞，并分别于２４、４８、７２ｈ时检测细胞的存活率。

１．２．６ 中效浓度的计算 存活率（ｆｕ）＝药物实验组Ａ 值／细胞对照组Ａ 值，抑制率（ｆａ）＝１－存活率（ｆｕ）。将中效方程ｆａ／ｆｕ＝（Ｄ／Ｄｍ）ｍ 两边取对数，得ｌｇ（ｆａ／ｆｕ）＝ｌｇ（Ｄ／Ｄｍ）ｍ＝ｍｌｇＤ－ｍｌｇＤｍ。设ａ＝－ｍｌｇＤｍ、Ｙ＝ｌｇ（ｆａ／ｕ）、Ｘ＝ｌｇＤ，则 Ｙ＝ｍＸ＋ａ。其中 Ｄ为药物浓度，Ｄｍ 为中效浓度，即抑制率为５０％时的药物浓度（ＩＣ５０），ｍ 为斜率，ａ为截距。

１．２．７ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染 色 实 验 收 集 细 胞，ＰＢＳ洗，Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染 色３７℃ ３０ｍｉｎ，制 片 荧 光 显微镜观察细胞核形态变化并拍照。
１．２．８ Ｃａｓｐａｓｅ－３活性 检 测 细 胞 按ｃａｓｐａｓｅ－３试剂盒的要求处理，参考 Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司的ｃａｓｐａｓｅ－３酶活力单位的定义，即一个酶活力单位表示为当底物 处 于 饱 和 状 态 下 时，在 ３７℃１ｈ 内 可 以 剪 切１ｎｍｏｌ Ａｃ－ＤＥＶＤ－ｐＮＡ 产 生 １ ｎｍｏｌ ｐＮＡ 的ｃａｓｐａｓｅ－３酶量，由此就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的ｃａｓｐａｓｅ－３。
１．２．９ 流 式 细 胞 术（ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ双 染 色法）检测各组细胞凋亡情况 通过血清饥饿法对Ｋ５６２细胞行同步化处理，各组药物作用４８ｈ后收集对数生 长 期 的 Ｋ５６２细 胞，ＰＢＳ 洗 涤 ３ 次，加 入５μｌ的 ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ和１μｌ的 ＰＩ混均，避光孵育１０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤１次，每管加入４００μｌ的ＰＢＳ，采用流式细胞仪检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率。
１．３ 统计学处理
数据 均 使 用 Ｅｘｃｅｌ表 格 进 行 录 入，同 时 采 用ＳＰＳＳ２０．０软 件 对 数 据 进 行 统 计 学 分 析。数 据 以ｘ珚±ｓ表示，两样本间的平均数比较使用独立样本ｔ检验，多 组 样 品 间 的 均数 比 较 使 用 单 因 素 方 差 分析，检验水准α＝０．０５。

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