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恒远告诉大家：关于WB实验的常见问题以及解决方案（5）
阅读：3136 发布时间：2012-8-22
上海恒远生物科技有限公司是一家生物技术企业，主要从事免疫学、分子生物学和常规生化试剂的研发、销售。并代理销售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家国外，致力于为广大高校、科研院所和企事业单位提供*的科研试剂和完善的技术服务，满足生物化学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等生物科技实验需求。
41、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？
答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂。
42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转120mA， 45-60min就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。
43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）.
44、我用的是可视marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。
答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。
45、是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？
答：对于发表文章的实验加内参，实验严谨。
46、核内抗原Western Blot内参选择什么合适？
答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。
47、做半定量Western Blot，内参β-actin，GAPDH哪个好？
答：选用beta-actin就可以。
48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？
答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。
49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBSTzui后那个T是Tween吗，浓度多大？
答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 （TBST）, NaCl：8g， Tris base：2.42g加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 调节pH 至 7.4, 加水定容至 1L。
答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂。
42、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转120mA， 45-60min就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。
43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）.
44、我用的是可视marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。
答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。
45、是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？
答：对于发表文章的实验加内参，实验严谨。
46、核内抗原Western Blot内参选择什么合适？
答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。
47、做半定量Western Blot，内参β-actin，GAPDH哪个好？
答：选用beta-actin就可以。
48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？
答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。
49、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBSTzui后那个T是Tween吗，浓度多大？
答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 （TBST）, NaCl：8g， Tris base：2.42g加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 调节pH 至 7.4, 加水定容至 1L。
50、封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下?
答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。
如果你想了解更多关于western blot的信息，来函！
答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。
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