ELISA新手难免会遇到一些问题，前段时间我公司技术就收到两位顾客的技术问题，今天的技术文章中，就把这两位客户的问题分享给大家，希望能帮助到遇到相同问题的同学！

    例1，客户提问：竞争法ELISA测定抗原时，固定抗体，酶标抗原和受检抗原竞争与固相抗体结合，请问能不能用酶标二抗（抗固定抗体的抗体）和受检抗原竞争呢？为什么？难道因为亲和力不一样？但是不都是抗原抗体反应吗？亲和力不应该是一样的吗？
    技术解析：当然不能了，二抗结合抗体的位点，和抗原抗体结合的位点，不相同！二抗与抗体结合的是抗体的Fc段，抗原抗体结合的是抗体的CDR区。就相当于一个人抓手，一个人抓脚，结合的位点不一样，构不成竞争关系。

    例2，客户提问： zui近才开始做Elisa，间接法检测抗体。我大致的步骤是包被（4度过夜），PBST洗涤，封闭（5%脱脂奶粉），洗涤，加入一抗，洗涤，加入二抗，洗涤，我设置的阴性对照就是步直接在孔中加100ul 包被液，没有加我的蛋白，照理说，没有蛋白zui后就不应该显色，怀疑是二抗没洗涤干净所以才显色，洗涤了至少5次以上，zui后还在纸上使劲拍干，但是zui后还是显色，求高人指点~~（包被液是碳酸盐缓冲液，稀释液assay buffer: PBS：KH2PO4,Na2HPO4.12H2O,NaCL,KCL,Tween-20，我的一抗二抗都是用这个稀释液配的，封闭液也是用稀释液配的脱脂奶粉，没有血清啊）
    技术解析：① 可能封闭效果不好；② 可能封闭液脱脂奶粉可以和一抗交叉反应；③ 一抗没有洗涤干净；④ 加样时操作出现错误。先确定封闭有没有问题，洗的话二抗确实多洗几遍没错，没有洗板机，每次洗可以摇晃板子，每遍1-2分钟，也可以多设置几个阴性孔，观察结果，看是不是没洗干净的问题。加样尽量加到底部，避免沾壁。

                    

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