毕赤酵母表达实验方法.

一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制
1．1 各种母液的配制
10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基） 4℃保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。
500*B     （0.02%生物素 Biotin）   4℃保存 保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。
100*H     （0.4%Histidine 组氨酸） 4℃保存 保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。
10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。
10*M （5%Methanol   甲醇） 保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。
10*GY （10%Glycerol   甘油） 保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。
100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）   4℃保存 保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。
1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。
1.2 常用溶液及缓冲夜
1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：
溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI （pH 8.0）
溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％ SDS（临用时配制）
溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加ddH2O至100 ml。
4℃保存。
1.2.2 10% 甘油 （Glycerol）：
将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。保存期为1年以上。
1.2.3   Rnase-H2O：
1ul Rnase 加入1ml 灭菌 dd H2O。4℃保存。
1.2.4   TE缓冲液：
10mmol / Tris-CI（pH 8．0）， lmmol / L   EDTA（pH 8.0）
1.2.5   STE缓冲液：
0.1mol / L,   10mmol / L Tris-HCl （pH 8.0）, 1mmol / L EDTA （pH 8.0）
1.2.6   SCE缓冲液：
1mol / L Sorbitol （山梨醇）, 10mmol / L 柠檬酸钠 ， 10mmol / L EDTA
1.2.7   1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）：
    132 ml 1M   K2HPO4
    868 ml 1M   KH2PO4
1.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0（1L）：
   242 g Tris
   57.1 ml Acetic Acid
   37.2 g EDTA
二．毕赤酵母表达的培养基配制
2.1   LB（Luria－Bertani）培养基：
Trypton     l％
 Yeast Extract 0.5％
 NaCl    l％
 PH 7.0
制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌*0F’时可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2   LLB（Low Salt LB）培养基：
Trypton     l％
 Yeast Extract 0.5％
 NaCl     0.5％
 PH 7.0
制作平板时加入 2％琼脂粉。121℃高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌*0F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。
2.3   YPD （又称YEPD）
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）
Trypton    2%
dextrose （glucose） 2%
+agar        2%
+Zeocin 100 µg/ml
液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4   YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：
yeast extract     1%
peptone    2%
dextrose （glucose） 2%
sorbitol    1 M
+agar        2%
+ Zeocin    100 µg/ml
不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5   MGY
Minimal Glycerol Medium （zui小甘油培养基）
（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。
2.6   MGYH
Minimal Glycerol Medium + Histidine （zui小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）
在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。
2.7   RD
Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）
（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）
1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；
2. 冷却后于45℃水浴；
3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2的山梨醇溶液混合。4℃保存。
2.8   RDH
Regeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）
在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。4℃保存。
2.9   RD及RDH平板的制备
1. 将186g的山梨醇和15~20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；
2. 参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；
3. 迅速制备平板。4℃可保存数月。
2.10   RD及RDH 的TOP 琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）
1.将186g的山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；
2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；
3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。
2.11   MD与MDH
Minimal Dextrose Medium +（Histidine）   zui小葡萄糖培养基 +（ 0.004 %组氨酸）
（含有：1.34%YNB；；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖）
1. 100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的无菌水定容至1000ml即可；
2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；
3. 如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15~20g的琼脂。4℃可保存数月。
2.12   SOC培养基：
Trypton       l％
Yeast Extract    0.5％
NaCl       0.05％
Glucose （1mol / L）     2%
121℃高压灭菌 20min，冷却后，4℃保存
三．主要试验环节的操作
3.1 酵母菌株的分离纯化
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。
3.2 pPICZαA原核宿主菌*0F’的活化培养
*0F’做为菌种保存在－70 ℃条件下，在进行扩大培养抽提质粒之前，先要进行活化培养。
接种*0F’于5ml LLB（加入25ug / ml Zeocin）中，37℃，200 rpm ，培养16～18小时。
3.3毕赤酵母表达的试验方法
3.3.1线状质粒DNA的脱磷酸化处理
为了防止载体质粒DNA的自身环化，用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理酶切后的质粒DNA，具体操作如下：
⑴ 建立反应体系：
线性化的质粒     35ul
10x CIP buffer   4ul
CIP              1ul
ddH2O            5ul
——————————————————————————
total     45ul
⑵ 在PCR仪上控制反应温度（加石蜡油封闭），37℃，15 min ；50℃，15 min；56℃，30 min（灭活）。
⑶ 在56℃未开始前停止，加入proteinse K ，用于灭活CIP，加入试剂如下：
反应物           45ul
10x 5％ SDS       7ul
10x EDTA （pH 8.0） 7ul
proteinse K       5ul
 ddH2O           6ul   
———————————————————
  total       70ul
⑷ 纯化使用QIAquick spin kit ，按照2.2.3.3步骤进行，20 ul 灭菌ddH2O洗脱纯化产物。进行1％琼脂糖凝胶电泳，120 V， 观察纯化结果，并大约估计DNA浓度。
3.3.2   E.coli *0F’ 感受态细胞的制备及转化
⑴ 取10 ul *0F’ 菌液，接种于 200ml LB液体培养基中活化培养，37℃ ，200 rpm，16～18小时。取100 ul菌液接种于 200 ml 液体LB培养基中。
⑵ 37℃ ，200 rpm，培养16～18小时。
⑶ 灭菌500 ml 离心管，4℃，4000 rpm，20 min 。得菌体沉淀。弃上清，菌体用10％甘油重悬并洗涤。重复洗涤3次。
⑷ 第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml 液体用于重悬菌体。
⑸ 从制得得感受态细胞中，取200 ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物 5ul ，混匀，不要产生气泡，在冰上放置 5 min。
⑹ 将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。
⑺ 使用电击穿孔仪进行转化，设置为 电压 2500 V，时间 5 ms。
⑻ 电击后，往电击杯中加入 800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，轻摇45～60 min。
⑼ 取全部均匀涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37℃ 培养12～16小时。
*注：设空载体做对照。
3.4   毕赤酵母电转化方法
3.4.1 菌体的准备：
1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培养过夜；
2. 取100~500µl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，至OD600达到1.3~1.5；
3. 将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
4. 按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
5. 按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
6. 按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；
7. 备注：可将其分装为80µl一份的包装冷冻起来，但会影响其转化效率（2周之内）。
3.4.2 电击转化：https://www.afzhan.com/Login/default.aspx?Stand_DownLoadOperate
8. 将5~20µg的线性化DNA溶解在5~10µl TE溶液中，与80µl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；
9. 将电转化杯冰浴5min；
10. 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击https://www.afzhan.com/Login/default.aspx?Stand_DownLoadOperate；
11. 电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中；
12. 将菌体悬液涂布于MD或RDB平板上，每200~600µl涂布一块平板；
13. 将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。
推荐：电压1.5kV；电容25µF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec。