成纤维细胞培养基微丝的染色及其对细胞松驰素B的反应

成纤维细胞培养基微丝的染色及其对细胞松驰素B的反应

　　(一)原理

　　微丝普遍存在于多种细胞培养基，对细胞的形状和运动有一定作用。细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。

　　(二)细胞松驰素B处理成纤维细胞与染色观察

　　1．在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片，在超净工作台内将一张盖片移入另一皿中继续培养，用作对照。

　　2．在有两片的平皿内加100μg／ml的细胞松弛素B 4滴继续培养半小时。

　　3. 将用细胞培养基松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次（在平皿内换五次培养液，每次都要摇动），继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复，接近正常。

　　4．对恢复的盖片与*张没用药的盖片一同做染色处理。

　　5．染色处理

　　①将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液三次，每次3分钟，洗去培养液。

　　②将盖片移入2％Triton X一100液，置37℃恒温箱内处理20～30分钟，以提取骨架以外的蛋白质，使骨架图像清晰。

　　③立刻将盖片移入M一缓冲液，换洗三次，每次3分钟。M一缓冲液有稳定细胞骨架的作用。

　　④将盖片移入3％戊二醛固定15分钟。

　　⑤将盖片移入0.2％考马斯亮兰染液中，染色15分钟。然后小心地用自来水冲洗，空气干燥。

　　(三)结果

　　光镜观察，微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色。在没用药的标本上，成纤维细胞培养基多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松驰素B处理的标本，由于微丝被破坏突起缩回，多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚台形成微丝，细胞形状恢复正常。