细胞生物学实验技术

www.afzhan.com/st38642/product_591997.html一、细胞化学技术
组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。
（一）固定
物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。
化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。
（二）显示方法
金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物zui终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。
Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。
联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。
脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。
茚三酮反应：显示蛋白质。
二、免疫细胞化学 immunocytochemistry
概念：根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。
免疫荧光法（immunofluorescent technique）：常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。
酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。
三、显微光谱分析技术
细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。
可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性和定量测定。
四、放射自显影术
用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。
原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。
一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。
14C半衰期为5730年，3H为12.5年。
五、分子杂交技术
具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。
（一）原位杂交（in situ hybridization）。
用于检测染色体上的特殊DNA序列。zui初是使用带放射性的DNA探针，后来又发明了免疫探针法。
（二）Southern杂交
是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。
将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。
六、PCR 技术
PCR即：polymerase chain reaction。
反应体系：①样品DNA；②引物（primer），约15-20个核苷酸；③4种dNTP；④Tag DNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermus aquaticus，zui适作用温度75~80℃，短时间在95℃下不失活。⑤缓冲体系和Mg2+。
反应过程：①变性：约90-95℃；②复性：约60℃左右；③延伸：70-75℃；④重复 “变性——复性——延伸” 过程20-30次循环。