透析法和葡聚糖凝胶G-50柱层析法

透析法

    荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。

（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。抗体

（2）浸入0.02mol/pH。

    7.1~7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50~100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3~4次PBS，约5~7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。

葡聚糖凝胶G-50柱层析法

    除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15~18ml（按床体积的5%~10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30~40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体zui先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。

    若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，太浓NH4+，在蛋白未*洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。zui后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。

    如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2~3.5ml荧光抗体。