产品介绍

Red NUPharoseFF是活性红120（又称普施安红HE-3B）活性染料键合在NUPharose琼脂糖微球上得到的亲和填料。活性红120是多环染料，与NADP+具有结构类似性，可用于纯化核苷酸依赖性酶、脂蛋白、乳酸脱氢酶、纤溶酶原、肽、激素等的纯化。除了作为亲和填料使用，本产品配基含芳香环和阴离子，也通过静电作用或者疏水相互作用进行非亲和纯化。

使用方法参考

 3.1 色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

（1）所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

（2）填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定体积。Red NUPharose FF的压缩比为1.15。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

（3）填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

（4）装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成 50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

（5）装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内保留少量的装柱液，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

（6）装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器），为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

（7）压柱：使柱内填料自然沉降（或 50~150 cm/h 的低流速下沉降），待填料沉降完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

3.2  柱效测定和评价

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。

3.3  平衡与上样（Equilibration & Loading）

在上样前，需用缓冲液A在操作流速下平衡层析柱，该过程通常需要5~10个柱体积的缓冲液A，以电导、pH等检测信号参数不变且与缓冲液A对应为准。可以选择磷 酸盐、Tris-HCl等常见的缓冲体系。

上样量可按“mg目标蛋白/mL填料"来设定，通常为DBC10%的50~80%，例如Red NUPharoseFF产品对的动态结合载量为~15mg/mL，纯化时的上样量可为7.5~12mg/mL。除了DBC10%，也可以测试上样流穿液中的目标蛋白确定上样量。上样前需要对样品进行离心（10000 g以上）、过滤（0.22或0.45μm）处理，以免堵塞色谱柱。

上样后需要3~10个柱体积的缓冲液A 再平衡层析柱。

3.5 洗脱（Elution）

通常在缓冲液A中添加3 M NaCl或者2 M KCl可将目标蛋白洗脱。

3.6  再生（Regeneration）

纯化后可用弱酸和弱碱性缓冲液交替冲洗色谱柱3~4 次，进行填料再生，例如0.1mol/L NaAc+0.5mol/L NaCl（pH4.5）和0.1mol/L Tris·HCl+0.5mol/L NaCl（pH8.5）。然后用平衡缓冲溶液平衡。

3.7 在位清洗（CIP）

通常上述的洗脱和再生过程可将填料彻底清洗。若发生柱压升高，或为了避免交叉污染，可采用以下溶剂进行在位清洗：0.1~0.5 mol/L NaOH、70%乙醇或30%异丙醇等。在位清洗可有效去除介质上的杂质，反向效果更佳。清洗后需用3~5 柱体积的纯水除去上述溶剂。

3.8  填料保存

填料的初始保存液为20%乙醇，使用过后可继续用20%乙醇并添加0.5M NaCl保存。保存温度在2~30 ℃为宜，不可冻存。