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小鼠P450胆固醇侧链裂解酶（P450scc） ELISA试剂盒说明书
2018-3-30 阅读(1361)
 提 供 商 |
南京信帆生物技术有限公司 |  资料大小 |
107KB |
|---|---|---|---|
 资料类型 |
WORD 文档 |  资料图片 |
|
 下载次数 |
210次 |  浏览次数 |
1361次 |
ELISA 的样本实验准备
在收集样本前都必须有一个完整的计划，必须清楚要检测的成份是否足够稳定。对收集后当天就进行检测的样本，及时储存在4℃备用。对于隔天再检测的样本，及时分装后冻存在-20℃备用，有条件的，-70℃冻存备用。标本应避免反复冻融。
液体类标本: 包括血清、血浆、尿液、胸腹水、脑脊液、细胞培养上清等。
- 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
- 血浆：应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
- 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。
- 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。
- 培养细胞：检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
- 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂，用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
- 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
- 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
第三部分 ELISA试剂盒的检测目的和实验原理
1.检测目的
本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc) 含量。
2.实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc) 水平。用纯化的小鼠P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc) 抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc) ，再与HRP标记的P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc) 抗 体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc) 呈正相关。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标 准曲线计算样品中小鼠P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc) 浓度。
第四部分 试剂盒组成
试剂盒组成 | 48T | 96T | 保存 |
说明书 | 1份 | 1份 |
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封板膜 | 2片（48） | 2片（96） |
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密封袋 | 1个 | 1个 |
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酶标包被板 | 1×48 | 1×96 | 2-8℃保存 |
标准品（400 ng/L） | 0.5ml×1瓶 | 0.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品稀释液 | 1.5ml×1瓶 | 1.5ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
酶标试剂 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
样品稀释液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
显色剂A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
显色剂B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
终止液 | 3ml×1瓶 | 6ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
浓缩洗涤液 | (20倍)20ml×1瓶 | (30倍)20ml×1瓶 | 2-8℃保存 |
第五部分 操作步骤
- 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
200 ng/L | 5 号标准品 | 150µl 的原倍标准品加入 150µl 标准品稀释液 |
100 ng/L | 4 号标准品 | 150µl 的 5 号标准品加入 150µl 标准品稀释液 |
50 ng/L | 3 号标准品 | 150µl 的 4 号标准品加入 150µl 标准品稀释液 |
25 ng/L | 2 号标准品 | 150µl 的 3 号标准品加入 150µl 标准品稀释液 |
12.5 ng/L | 1 号标准品 | 150µl 的 2 号标准品加入 150µl 标准品稀释液 |
- 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50µl，待测样品孔中先加样品稀释液 40µl， 然后再加待测样品 10µl（样品zui终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽 量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
- 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。
- 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用
- 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此
重复 5 次，拍干。
- 加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。
- 温育：操作同 3。
- 洗涤：操作同 5。
- 显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
10 分钟.
- 终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
- 测定：以空白孔调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。
