酵母表达外源蛋白

1、 菌株

用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。

2、温度：
　在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。

3、pH

手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的的rHSA，zui适pH大概5-6左右。pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。

4、偏爱密码子

codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大(30KD以上)，结构复杂(如一些蛋白酶)，二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。

5、表达时间与空质粒转化对照

诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。

6、污染

每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌(30ml玻璃管，比LB管大一点)，纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。

污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后，就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。

7、不表达

蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。

8、表达量

30KD,10mg/L表达量已经很高，zui直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。

9、糖基化

酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X S/T就是潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1－3KD左右的糖基。另外可能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达，不存在糖基化的问题。

10、表型与表达

重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌株表达较好。

11、培养基

YPD：zui基本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY：诱导表达用；MD：电转化后筛选his＋用。
YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。

YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入；配YPD时可以加入YPD一起灭菌，但时间不能太长，温度不能太高，一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。

小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好(效果不比含YNB的差)。

如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。
用无机盐进行大规模发酵，更省钱。

大规模发酵时，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用纯氧并不昂贵，在武汉买个钢瓶600元左右，一瓶纯氧20元。一个批次100h左右估计3－4瓶氧气。

关于Tryptone和Peptone的选择：

1)用培养E.coli的Tryptone替代Peptone对有些酵母菌可以,例如一般的表达酵母.但是对有酵母菌些不行.例如做双杂交的AH109,Y187之类表达酵母，根本就长不好．

2)Tryptone和Peptone虽然都是营养胨，但营养成分不一样．即使是一般的表达酵母可以在Tryptone生长，生长状态也没有在Peptone中好．但tryptone和peptone就是含量上有点不同外，其他没什么区别，用peptone的目的不是为了提供氮源，提供氮源的是培养基里面的YNB。

3)如果要求不高，一般使用也还凑合．尽可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它国产的蛋白胨都可以很正常的培养绝大多数酵母菌．

4)用含Peptone的培养基颜色很深，纯化表达蛋白时颜色要去掉，所以还要进行麻烦的后续处理。而改用Tryptone后，培养基颜色变得很浅，和LB(液体)颜色差不多，后续处理要简单些。invitrogen说明书说 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶类水解，加入peptone的目的就是竞争性抑制目的蛋白的水解，因为peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。

培养毕赤酵母,书上说BIOTIN储液是水溶液,但事实上BIOTIN很难溶于水, 可以稍稍水浴加热一下。配制500×BIOTIN stock solution(0.02％)有这么3种方案：
1)、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；
2)、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；
3)、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。MD、MM属于基础培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子(如生物素)。所以肯定要加的。

附：无机培养基配方

BSM无机培养基：

85% H3PO4 26.7ml/L

CaSO4 ·2H2O 0.93g/L

K2SO4 18.2g/L

MgSO4·2H2O 14.9g/L

KOH 4.13g/L

甘油 40g/L

PMT1 4.0ml/L

100%氨水调pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫 酸铵调pH5.0，氨水用于上罐调pH(便宜，方便)。诱导表达前调pH6.0。pH5.0是为了防止BSM形成磷酸钙沉淀，pH6.0是表达HSA融合蛋白的zui适pH。

BSM高压灭菌后再加4.0ml/L 过滤除菌的PTM1(微量元素)4.0ml/L 。100%的500ml甲醇加6ml PMT1，用于补加甲醇诱导表达目的融合蛋白。

PMT1(1L)配方：

CuSO4·5H2O 6.0g/L

KI 0.088g/L

MnSO4·H2O 3.0g/L

Na2MoO4·2H2O 0.2g/L

H3BO3 0.02g/L

CoCl2·6H2O 0.5g/L

ZnCl2 20.0g/L

FeSO4·7H2O 65.0g/L

Biotin 0.2g/L

浓H2SO4 5.0ml

12、蛋白降解

分泌表达的目标蛋白比胞内蛋白确实容易被降解。可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物(比如酵母酸)；3、摸索zui适下罐(摇瓶也一样)，宁可少表达点也别给降解光了。实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点(当然不能影响表达和蛋白活性)。
Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of specific foreign proteins secreted into the P.pastoris culture medium.
1)、The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one or more problem proteases.
2)、The second strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH 3.0 and pH7.0.
3)、The third strategy involves elevating the level ofammonium in the culture broth adequay, which is explained by the hypothesis that portease activity is induced under nitrogen starvation.
The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.

连续两个或两个以上的碱性氨基酸相邻的结构，如果有的话，在这一位点是很容易被蛋白酶切断，产生偏小的多肽。

13、换液

通常用BMGY和BMMY是要换液的，但也可以不用换液。培养到菌液浑浊后，直接向BMGY里加甲醇诱导就行了。GS115在第4天达到了zui高表达量。换液不是必要的，适量甘油的存在有时反而会使表达量提高，

10ml生长培养后，等体积换液。我用250三角瓶，装量25mlBMGY发酵2天，再取0.5ml加入BMMY(250三角瓶，装量25ml)中诱导发酵.

BMGY和BMMY的换液方式有2种：
1)一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。另外2)一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。
是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。

总之，无论是取样还是补料、加甲醇，尽量用灭菌的移液管(因为比较长，不容易引起污染)。当然，微量的如200ul，还是用移液器加(快而准确)，可以在瓶口处往瓶内加入100％甲醇等。用新开启的分析纯甲醇，我们都没有过滤或者其他处理，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。实验室里也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。

14、上罐表达

放罐时OD能达到400左右，生长过程zui高OD500左右，重组蛋白发酵水平大约300-400mg/L。30g/L甘油初始培养OD约40左右，流加约420g/L甘油后，菌体密度达到zui高约500。开始诱导后，起初3－5h之内流加的甲醇很少，发酵体积变化小，但是菌体的OD值是快速下降的，一般是原来的90%左右，每次都是这样，确切原因我们也还不清楚，估计是酵母从高速生长转向营养饥饿过程中，菌体形态发生很大变化，比如大小、含水量、折光率等。随酵母逐渐适应利用甲醇为碳源，mut＋型酵母的诱导可以将甲醇的流速逐步提高，此时仍然能发现OD值下降，我们认为这主要是发酵体积增加的原因造成的。我们诱导过程一般增加约40%的体积7L到10L，zui终OD值约为zui高OD值的80%左右，简单换算一下，应该知道菌体生物量增加约1/7。其实，这和毕赤酵母代谢甲醇途径也是一致的，甲醇首先被氧化成甲醛，一部分继续氧化成甲酸进而生成CO2，产生菌体所需的能量，另一部分可以被菌体同化，进入小分子碳架的合成途径，提供菌体生长所需的碳源。

15、菌体密度：

菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。

麦芽浸提液培养酵母(不换液，补料)，生长阶段结束后，密度可达到10-12，诱导培养结束后，密度可达到18左右。
如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，加入1/10——1/2体积的BMMY进行诱导培养(即浓缩培养)，细胞密度也可达到20以上。
通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600可达到40-60及以上。摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。
摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。

17、菌种保存

用15%甘油做保护剂，-70度长期保存，-20度短期保存使用。不过要注意冻存前一定充分混匀，酵母菌体很容易沉降到EP管底部，保存效果大打折扣。

一般OD2-6的YPD过夜菌吸取300ul菌液到灭菌的ＥＰ管然后加等体积的甘油，混匀，放于－２０度．保存长的话放－８０度冰箱。

重组菌株传代次数太多，确实可能存在菌株退化的现象。这在用动物细胞表达系统如CHO，NS0系统更为明显，所以一定要保存好zui原始的重组菌株，每次从中划板，挑单克隆表达，尽量减少菌株传代次数。不行的话再用相同的方法重新转化筛选高表达菌株。

GS115的鉴定方法

接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。GS115的his4基因突变了，不能在组胺酸缺陷型培养基上生长，一般的YPD培养基营养丰富，什么都有了，而YNB却只含基本氮源，GS115应该在上面不长，就是从YPD上挑菌落，在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下，在HIS上长而YNB上不长的是GS115，这样能挑到纯的，以防突变。
附：TCA沉淀方法；ELISA protocol；原位双膜法快速检测阳性表达株：

TCA沉淀方法

培养基上清直接电泳跑出来的条带经常很难看，可以TCA沉淀浓缩后跑电泳，。表达上清很少有直接考染能看得到条带的， 1ml表达上清浓缩到20ul直接电泳。一般表达量大于1mg/ml可以看到明显条带，但重复性不好。

具体步骤：

1.菌液10000g,离心5分钟，收集表达上清。

2.取500-1000ul上清于EP管中，加入1/9体积的100％TCA，颠倒10次混匀。

3.样品置于冰浴中大于0.5小时，过夜效果更好。

4.15000g,离心10－20分钟,可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。

5.将EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱10－20分钟，待管底无明显液体残留，如果管壁还残留有液体，可以吸水纸吸掉。可以改成室温或用电吹风，关键是除去管底和管壁残余液体。

6.15000g,离心10－20分钟,用20ul枪头尽量吸去管底残余的液体，此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率，一般zui多几ul或者没有，注意不要吸到沉淀。

7.EP管倒置于吸水纸长，37度烘箱5分钟，确认管壁和管底没有液体残留。

8.加入20－50ul Loading buffer，95度加热10nim，一般沉淀会自动溶解，如果不溶，用手指轻弹管壁或用20ul枪头轻轻吸打，注意整个操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余TCA。如果蓝色的Loading buffer不变成，说明残余TCA吸弃了干净，如果变黄，一般不影响电泳。此方法连丙酮洗这一步都省了，而且不影响电泳效果。

或者第5步和第6步改为丙酮洗:

5.加入200ul冰冷的丙酮，用手指轻弹EP管，洗去管底和管壁残余的TCA。

6.15000g,离心10－20分钟,倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。

样品是酵母细胞超声后离心获得的上清，用Loading buffer溶解蛋白沉淀，始终不能溶解，而且加热超过10分钟以后也依旧不溶解。Typtone做TCA沉淀效果不好，沉淀很多，颜色是绿的，不好溶，Peptone沉淀是黑色的，比较少，一般用丙酮洗一步后很好溶。沉淀不溶，很可能是TCA没有除干净)

ELISA protocol：

用BMMY培养基一般表达1－2天收集表达上清，稀释一定比例铺板做ELISA检测

1.取5－10ul BMMY表达上清用0.05M NaHCO3稀释到100ul铺ELISA板，37度或室温振荡大于1小时。注意一定要做一个GS115空菌株表达上清作为阴性对照，还找一个带有histag的蛋白作为阳性对照。

2.TPBS洗板3次，方法：倒掉铺板液，倒置于毛巾上轻轻拍打几次，加TPBS至满，重复。

3.加封闭液(TPBS加1％脱脂奶粉)350ml/孔，室温下放置40分钟－1小时，TPBS洗3次。

4.加封闭液稀释的histag一抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。很多公司都有histag的单抗，个人觉得Qiagen和Pharmacia单抗较好，Invitrogen和Labvision的一般般，一般1：1000－5000稀释，不同公司的抗体效价不同。

5.加封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。二抗很多公司有，国产的华美都可以，1：500－1000。如果是HRP标记的histag抗体，不加二抗直接显色。

6.加入OPD显色液100ul/孔，避光反应约10－30分钟。显色液配方：1mg/ml OPD于0.1M 柠檬酸钠，PH5.5，0.1%H2O2，－20度避光保存。也可以用DAB显色。

7.1M H2SO4 100ul/孔终止反应，酶标仪测OD490nm。

TCA沉淀考染看不到条带，可以打算作ELISA，但可能上清里面杂蛋白太多，抗原(目的蛋白)不可能包被到板子上，所以几乎不可能检测到的。他们建议作点杂交，就是把少许上清点到PVDF膜上，以后就按照western blot 就可以了。ELISA使用多抗，意义不是很大，因为确实阴性对照也显色，和阳性结果差不了太多，特别是蛋白表达水平不高的话，两者区别很不明显，一抗是自己制备的多抗,空白值在0.2左右,阴性对照(即空白宿主自身表达的上清)OD值大约在0.35-0.4之间,目的蛋白测的值却在0.6-0.65.可见效果还是比较明显的.因为是多抗阴性对照难免会对结果产生影响.没有单抗也只能这样了.

原位双膜法快速检测阳性表达株：

1) 将醋酸纤维素薄膜置于MD/His -平板的His + 转化子菌落上,用涂布棒轻压使醋酸纤维素薄膜*湿润并赶尽气泡, 使所有菌落转移到醋酸纤维素薄膜上.

2) 在BMMY板上置一同样大小的硝 酸纤维素薄膜, 并将醋酸纤维素薄膜菌落向上置于硝 酸纤维素薄膜上. 30 ℃孵育18 h 后, 将醋酸纤维素薄膜移至MDP2His 平板上, 4 ℃保存

3) 将硝 酸纤维素薄膜取下, 6 %小牛血清37 ℃封闭2 h , TBS-T ( Tris-NaCl 缓冲液加0105 %吐温20) 洗3 次( 每次10 min) . 加一抗室温孵育2 h , TBS－T 洗膜3 次. 然后二抗室温孵育2 h , TBS2T 洗膜3 次. zui后显色。

在强弱不等的颜色中挑选染色zui强的克隆，做诱导表达进一步验证。操作时，一定要记好位置，以免不能将膜上的克隆和板上的克隆对上。

纤维素膜的选择根据？都用醋酸膜行吗？

以后的步骤就基本上是做western，所以用硝 酸纤维素膜通过虹吸将醋酸纤维素膜上的菌落分泌的液体转到硝 酸膜上，相当于western的转膜过程。