SSR及PAGE电泳

SSR简介

所有真核生物基因组中都有一类叫微卫星（microsalite）或简单序列重复（simple sequence repeats）的序列，它是由2-5个核苷酸首尾相连重复多次构成的一段DNA序列，具有很强的保守性。可以根据这段序列两边的序列设计引物，用PCR方法扩增出中间的SSR序列。

在设计引物的时候，遵循的原则与一般PCR引物的设计相同，每条引物一般为18-24个核苷酸，（G+C）%含量接近50 %（Tm为55℃左右），避免引物内二级结构的产生及某个核苷酸的连续出现，3'末端富含GA，PCR扩增产物在100-300 bp之间。

由于SSR扩增为特异性扩增，相对来说，重现性和稳定性都较好，但由于每对引物（G+C）含量不同，扩增产物长度不同，所以有必要给每对引物一个合适的扩增条件，这一般可通过改变反应液中Mg2+的浓度、反应的退火温度、延伸时间和循环指数来获得清晰且重复性好的条带。SSR扩增片段小（一般在300 bp以下，不同材料间差异小（一般为几个bp），故通常使用聚丙烯酰胺电泳。

由于简单序列的重复次数在同一物种的不同基因型间差异很大，因此SSR是一种多态性很高的分子标记。　

聚丙烯酰胺凝胶电泳

丙烯酰胺是一个单体，其结构为：

通常由过硫酸胺提供并可被TEMED（N, N, N', N'-四甲基乙二胺）所稳定的自由基可以引发一个链式反应，使丙烯酰胺单体合成长链。双功能基团N, N'-亚甲双丙烯酰胺参与聚合反应时，链与链之间交联成凝胶。其孔径由链长和交联度所决定。链长由聚合反应中丙烯酰胺的浓度（3.5-20%）所决定：每29个丙烯酰胺单体可形成1分子的交联体。

聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶费事。聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开并封以绝缘物，在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制于凝胶顶部的一个窄层里。聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：1）分辨率很强，长度仅仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开；2）所能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽而不致显著影响分辨力；3）从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求zui高的实验。
主要试剂
1、SSR引物（从公司购得）
2、10×PCR Buffer、25 mM MgCl2、2.5 mM dNTP、Taq DNA聚合酶（5U/μL）、dd H2O
Taq DNA聚合酶购自TaKaRa，其余试剂附送。
3、40%丙烯酰胺（100mL）： 38g丙烯酰胺
2g N, N'-亚甲双丙烯酰胺
加dd.H2O定容，37℃搅拌溶解，室温避光保存。
4、过硫酸胺10% （10mL）： 1g过硫酸胺溶于10 mLdd.H2O中，4℃保存。
5、5×TBE（1000mL）： 54g Tris碱，27.5g硼酸，20mL 0.5mol/L EDTA （pH8.0）
6、6×上样缓冲液（100mL）： 2.5g溴酚蓝
2.5g二甲苯青FF
40g蔗糖
加dd.H2O定容，37℃搅拌溶解。4℃保存。
7、琼脂糖
8、EB染色液

实验步骤
一、SSR扩增
1、模板稀释
取2μL定好量的DNA原液，加入38 μL dd H2O，轻轻吸打混匀。
2、反应混合液配制
在0.5mL Eppendorf管中加入下列试剂：

稀释DNA 2 μL
primer 各0.5 μL
10×PCR Buffer 2.5 μL
dNTP 2 μL
MgCl2 1.5 μL
Taq酶 0.2 μL
加dd H20至总体积 25 μL
加完样后，加一滴石蜡油，离心混匀。放入PCR仪，盖好盖子。
3、SSR扩增程序
94℃ 3 min
94℃ 30sec
Tm （ 48-65℃） 50sec 40cycles （退火温度视引物而定）
72℃ 1 min
72℃ 7 min
反应结束后，取出10 μL左右用于电泳检测。
二、电泳检测
1、安装胶模
将准备灌胶的玻璃板、间隔片、梳子等，用去污剂洗涤，自来水冲洗，凉干，酒精檫拭。按要求组装好灌胶装置。
2、配制丙烯酰胺溶液
根据所用玻璃板的大小和间隔片的厚度，估计所需丙烯酰胺溶液的体积。不同浓度的胶各成分配比如下表（总体积100 mL）：
试剂                                              配制不同浓度凝胶所用试剂的体积
                                                        3.5% 5.0% 8.0% 12.0% 20.0%
40%丙烯酰胺（mL）                      8.7 12.5 19.9 30.0 50.0
dd.H2O（mL）                                    70.6 66.8 59.4 49.3 29.3
5×TBE（mL）                                      20 20 20 20 20
10%过硫酸胺（mL）                                0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
TEMED（mL）                                         35 35 35 35 35
3、灌胶
将配制好的溶液倒入胶模，速度均匀流畅，防止引入气泡。将玻璃板斜靠、静置，小心插入梳子，等其凝固。检查胶液是否流出。
4、丙烯酰胺的聚合
30-60分钟后，观察胶液是否聚合。聚合完后，在梳子下方可以看见折射不同的纹线。
5、拔梳子
用1×TBE浸润凝胶的顶端2-4分钟，小心拔出梳子。立即用1×TBE冲洗一下加样孔，以防止梳子所留存的少量丙烯酰胺溶液在加样孔聚合，产生不平整的表面。
6、凝胶的装载
将胶模夹在电泳槽上，胶模与电泳槽接触的边缘用热琼脂糖（50℃左右）封边。
7、加入电泳缓冲液
在电泳槽内加满1×TBE溶液。用湾头吸管或注射器排除气泡。
8、加样
用吸管吹打，使加样孔整齐划一。用小移液枪头或注射器针头加入PCR反应产物（已加过上样缓冲液）。
9、电泳
接好电极，以1-8V/cm电泳。
10、紫外检测
电泳结束后，小心取出胶板，放入0.5 mg/mL的EB溶液中，室温染色15分钟。在紫外灯下检测DNA条带。记录其多态。
结果分析
每个扩增样品会呈现若干条带，分子量大小一般为几百bp。
同一模板，不同引物扩增时，扩增结果往往不同。
同一引物，不同模板扩增时，扩增结果往往不同。
实验中要调整退火温度、模板用量、反应时间等条件，以达到的扩增效果。
小心使用丙烯酰胺、EB等有害物质，禁止污染。