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三种常用免疫电泳技术

时间：2011-12-6阅读：1433
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免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反映的结合产物。这种技术有两大优点，一是加快反应的速度，二脸皮是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分开，再分别与抗体反应，以此做更细微的分析。免疫电泳技术的种类有很多，这里仅将常用的技术介绍如下：
一、放射免疫电泳技术
将放射性元素标记的抗体（或抗原）与相应的抗原（或抗体）沉淀时，沉淀线通过自显影而证实。所谓自显影，就是通过复合物中的标记同位素在蜕变过程中放出的射线，作用于感光材料的卤化银晶体而产生潜影，再经过显影把“像”显示出来。这样，能检出肉眼看不见的沉淀线，从而提高反应的敏感性，这种方法可应用于凝胶中的所有反应。
免疫电泳中所使用的材料有
1．放射性同位素标记的抗原或抗体
2．X—射线胶片或全色胶片
3．显影液与定影液
4．其它同对流免疫电泳
具体操作方法为：
1．按对流免疫电泳制备凝胶板并打孔。
2．加样 阴孔内加抗原，阳孔内加抗体。在加被检抗体样品时，迅速加入标记抗原（2000~3 000cpm），并使之混合，勿使抗原吸收后再标记抗原，以免由于标记原的滞面而形成假阳性。
3．电泳 电流2.6cm×7.5cm的小板用4mA。
4．电泳后，平板浸在3％HCl中漂洗8h，换液2次。
5．用流水漂洗过夜。
6．干燥 室温或鼓风机吹干。
7．曝光 在暗室将胶片切成与平板一样大小，然后将药面密接凝胶面，再在胶片上压一张玻板，用黑布包严，皮筋扎紧，曝光时间与所用同位素及保存期有关。181I，一周内5h~10h；1~2周内24h；2~3周内48h。125I，在2个月内10h。
8．冲洗 全色胶片冲片方法，水洗、20℃显影10min、水洗、定影、水洗、凉干，观察结果。
结果判定
在抗原抗体孔之间形成一条清晰的黑色影像者，判为阳性。

二、对流免疫技术
对流免疫电泳技术实质上是定向加速度的免疫双扩散技术，其基本原理是：在琼脂板上打两排孔，左侧各加入待测的抗原，右侧孔加入相应的抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电后，带负电的抗原泳向阳极抗体侧，而抗体籍电渗作用流向阴极抗原侧，在两者之间或抗体的另一侧（抗原过量时）形成沉淀线
材料
1．1%，PH8.6，0.075M巴比妥缓冲液。
2．抗AFP血清，已知AFP阳性血清，待检病人血清。
3．玻片、吸管、打孔器、毛细滴管、电泳仪等。
方法
1．将用缓冲液配制好的1.2%琼脂隔水加热溶化，趁热吸取3.5ml加于玻片上，冷凝后打孔，孔直径3毫米，二孔间距离3毫米。
2．分别从上至下向左列1、3、5孔内加入抗AFP血清；向右列2孔内加待检病人血清，4孔内加已知AFP阳性血清作为阳性对照，6孔内加已知阴性对照血清。各孔加满为度，勿使外溢。
3．将琼脂板置于电泳槽内，抗原端入阴极侧，抗体放阳极侧，二端贴上浸透电泳缓冲液的4层纱布条。
4．通电，固定电压5-6伏/厘米长，通电45~60分钟左右。
结果观察
电泳毕，关闭电源，取出琼脂板。在黑色背景上方，透过散射光线，首先观察3与4孔间（阳性对照组）、5与6孔间（阴性对照组）的白色沉淀线是否出现；再看试验孔，如孔间未出现这样的沉淀线，则该待检血清为AFP阴性血清。

三、火箭免疫电泳
火箭免疫电泳又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，是将电泳与单向扩散结合的一种免疫技术，实际上是加速度的单向扩散。将抗体溶入琼脂后制板，在琼脂板的一侧打孔，加入待检样品及不同浓度的标准抗原。电泳时抗原在含定量抗体的琼脂中向正极移动，并形成浓度梯度，在适宜的部位形成火箭状的沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的含量成正比，故可定量测定抗原。
方法：
1、制备琼脂板
将抗体血清按一定比例与溶化好的1.5%琼脂在56℃水浴中混匀，迅速浇注成2毫米厚的琼脂板。
2、打孔
3、加样：分别加入已知浓度的标准抗原溶液和待测抗原，每孔10微升。
4、电泳：将琼脂板放入电泳槽，抗原放阴极侧，抗体放阳极侧，两端贴上浸透电泳缓冲液的4层纱布条。固定电压5~6伏/厘米长，通电时间为45~60分钟左右，观察结果。
火箭电泳操作应注意以下几点：
1.所用琼脂可选择无电渗或电渗很小的。否则火箭形状不规则。
2.注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清楚的云雾状或圆形皆提示未达到重点。
3.标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源后加样。否则容易形成宽底峰形，使定量不准。
4.做IgG定量时，由于抗原和抗体的性质相同，火箭峰一电渗呈纺锤状。为了矫正这种现象，可用甲醛与IgG上的氨基结合（甲基化），使本来带两性电荷的IgG变为只带负电荷，加快了电泳速度，抵消了电渗作用，而出现伸向阳极的火箭峰。

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