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上海科兴商贸有限公司
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阅读:1547发布时间:2016-1-28
酶试剂是磷钨酸和磷钼酸的混合物,它在碱性条件下极不稳定,可被酚类化合物还原产生蓝色(钼蓝和坞蓝的混合物)。
酪蛋白经蛋白酶作用后产生的*可与酚试剂反应,所生成的蓝色化合物可用分光光度法测定。
(1)酚试剂:见实验1-15Folin试剂乙;
(2)0.55mol/L碳酸钠溶液;
(3)10%三氯乙*溶液溶液;
(4)0.5%酪蛋白溶液;称取酪蛋白2.5g,用0.5mol/L的氢氧化钠溶液4ml润湿,加0.02mol/L ph7.5磷酸缓冲液少许,在水浴中加热溶解。冷却后,用上述缓冲液定容至500ml。此试剂临用时配制;
(5)0.02mol/L ph7.5磷酸缓冲液;称取*(NaHPO4·12H2O)71.64g,用水定容至1000ml为A液。称取*(NaHPO4·2H2O)31.21g,用水定容至1000ml为B液。取A液840ml,B液160ml,混合后即成0.2mol/L(ph7.5)磷酸缓冲液。临用时稀释10倍;
(6)100ug/mL*溶液;称取烘干的*100mg,用0.2mol/L盐酸溶液溶解,定容至100ml,临用时用水稀释10倍,在分别配置成集中10-60ug/mL浓度的*溶液
(7)酶液;称取1g枯草芽孢杆菌蛋白酶的酶粉,用少量0.02mol/L ph7.5的磷酸缓冲液溶解,然后用同一缓冲液定容至100ml。震摇约15min,时期充分溶解,然后用干纱布过滤。吸取滤液5ml,稀释至适当倍数(如20/30或40倍)供测定用。此酶液可在冰箱中保存一周。
操作
1、绘制标准曲线
取不同浓度(10-60ug/mL)的*溶液各1ml,分别加入0.55mol/l碳酸钠溶液5ml,酚试剂1ml。置30℃恒温水浴中显色15min,用空白管(只加水,碳酸钠溶液和酚试剂)做对照测定A680,以A680为纵坐标,*的微克数为横坐标,绘制标准曲线。
2、酶活力测定
吸取0.5%酪蛋白溶液2ml置于试管中,在30℃水浴中预热5min后加入预热(30℃ 5min)的酶液1ml,立即计时。反应10min后,由水浴取出,并立即加入10%三氯乙*溶液3ml,放置15min后,用滤纸过滤。
同时另作一对照管,即取酶液1m*加入3ml10%的三氯乙*溶液,再加入0.55mol/L的碳酸钠溶液5ml,混匀后再个加入酚试剂1ml,立即混匀30℃显色15min。以加水的一管做空白,侧对照及样品的A680.
计算
规定在30℃、ph7.5的条件下,水解酪蛋白每分钟产生*1ug为一个活力单位,则1g枯草芽孢杆菌蛋白酶在30℃,PH7.5的条件下所具有的活力单位为;
(A样-A对)·K ·N
式中A样;样品液的A680; A对;对照液的A680; K;标准曲线上A680为1时的*微克数;t;酶促反应的时间(min),本实验 V:酶促反应管总体积(ml),本实验V=6; N:酶液的稀释倍数,本实验N=2000.
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