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如何操作elisa试剂盒

阅读:389发布时间:2015-11-23


Elisa试验是一种敏感性高,特异性强,elisa试剂盒重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存,操作简便,结果判断较客观等因素,已广泛应用在免疫学检验的各领域中。ELISA检测试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎(HEV)病毒 IgM 抗体ELISA检测。

以下为具体操作步骤:

方法一:用于检测未知抗原的双抗体夹心法

1. 包被:用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃ 过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。

2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。

3. 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小时,洗涤。

4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分钟。

5. 终止反应

6. 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+"、“-"号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。

 方法二: 用于检测未知抗体的间接法

1.  用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4过夜。次日洗涤3次。              

2.  加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照) 

 3.  于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37孵育30-60分钟,洗涤,zui后一遍用DDW洗涤。

4.  加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分钟。

5.  终止反应

6.  结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+"、“-"号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔OD值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。




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