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原代细胞的分离和制作的消化分离法的操作步骤

阅读：544发布时间：2015-5-21

（1）剪切把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。
（2）加液漂洗将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。
（3）消化加入消化液（*或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。*消化时间不宜过长。
（4）弃去消化液采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。
（5）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入*培养基。
（6）机械分散采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

注意事项如下：
（1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对*和EDTA的抑制作用。
（2）胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。

（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。


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