在反相色谱中,甲醇和乙腈是的二种有机试剂，由于二者性质的差异，在使用中有一定的区别。
1价格，乙腈高于甲醇
在分析成本上，HPLC级的乙腈，价格比HPLC级的甲醇高的多。因此，一般的液相色谱分析有机试剂甲醇为多。但文献所示的条件多用乙腈。
2吸光度，乙腈低于甲醇
所谓的HPLC级是指除去具有吸收UV的物质,其在规定的吸收波长上的吸光度小于规格值,但并不是指的纯度高。
从这四种试剂的吸收光谱看，HPLC级的乙腈吸收最小，尤其在低波长上。因此在UV检测时，其产生的噪音最小，在低波长尤其明显。所以在UV的低波长上，高灵敏度检测用HPLC的乙腈最合适。另外，在UV的梯度检测上，HPLC的乙腈产生的鬼峰最少，同时由于其低的吸收值，梯度变化其吸收值变化最小，较大范围内的反相有机试剂梯度用HPLC乙腈宜。
甲醇的HPLC级和优级的吸收光谱相差不大，但优级不能保证吸光度，因此还是尽量使用HPLC级。
3压力，乙腈低于甲醇
色谱柱内的压力，同很多因素有关，包括长度、内径、颗粒大小、填料性质、流速、温度及流动相等。但在实际分析过程中，影响压力变化主要是流动相中有机溶剂和缓冲液混合比例的不同，图中表示了水/乙腈，水/甲醇混合液的比例与压力的关系。从图中可以看到，甲醇与水混合压力增高，而乙腈同样与水混合并不如此，乙腈明显优于甲醇。同时我们也看到温度对压力的影响，温度升高，压力下降。
4流动相脱气，乙腈要注意
这里只讨论预先混合的流动相配置问题。甲醇与水混合时会发热，温度升高，多余溶解的空气较易变为脱出气泡，容易脱气。而乙腈与水混合是吸热反应，随着温度慢慢回到室温，产生气泡，所以要考虑脱气。
5洗脱强度，一般而言，乙腈大于甲醇
乙腈和甲醇与水混合二者比例相同，一般情况下，乙腈的洗脱能力强，尤其是混合比例低时。例如从和的洗脱看，相同的保留时间，乙腈的比率只需甲醇的一半都不到，而另一方面，当有机溶剂100％或与此非常接近时，对于胡萝卜素和胆甾醇来看，甲醇的洗脱能力往往比乙腈强。
6分离选择性，有差异
乙腈和甲醇在分离的选择性上有一定的差异，尤其是极性或离子化合物，出峰次序往往会不一致。在图4中，和苯甲酸的洗脱次序改变。这是由于有机溶剂的化学性质不同所致（甲醇是质子性，乙腈是非质子性）。因此，当用乙腈（甲醇）不能获得良好分离时可以试试甲醇（乙腈）。
7峰形，有时出现差异
对于像水杨酸化合物等，用乙腈时脱尾大，用甲醇则可抑制脱尾。这是由于对于硅表面与目标成分有相互作用的流动相的有关方，因有机溶剂分子的化学性质不同而异，或者是对成分溶解能力的差异所造成的。
可是，一般情况下，聚合物反相柱在使用甲醇时比硅胶柱更具有峰形宽的倾向，特别是用聚苯乙稀柱分析芳香族化合物时常见，而用乙腈则效果好的多。
8结论
总之，对于反相色谱中常用的乙腈和甲醇，一般情况下使用HPLC乙腈，但用乙腈达不到效果时，可以试试HPLC级甲醇。
