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超氧阴离子检测试剂盒微量法检测说明书

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。

测定原理：

超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成 NO₂^－，NO₂^－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成红色的偶氮化合物，在530nm处有特征吸收峰，根据A₅₃₀值可以计算样品中O₂^－含量，反应式为 NH₂OH +2O₂^－＋H^＋→ NO₂^－＋H₂O₂＋H₂O。

自备实验用品及仪器：

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、氯仿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 8mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂四：氯仿，自备。

超氧阴离子检测试剂盒提取

1. 植物、动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后 10000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。

3. 血清或培养液：直接测定。

测定操作表

1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至530nm。

2、操作表

超氧阴离子含量计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

超氧阴离子检测试剂盒标准曲线：y=0.0115x-0.0038，R²=0.9986

1. 组织：

（1）按照样本质量计算

超氧阴离子含量（μmol/g）= (A₅₃₀ +0.0038)÷0.0115×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×10^-3×2= 1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷W

超氧阴离子产生速率（μmol/ g·min）=1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷W÷T

=0.087×(A₅₃₀ +0.0038)÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量（μmol/mg prot）= (A₅₃₀ +0.0038)÷0.0115×V 反总÷(V 样×Cpr)×10^-3×2=1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷Cpr

超氧阴离子产生速率（μmol/ mg prot·min）=1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷Cpr÷T

= 0.087×(A₅₃₀ +0.0038)÷Cpr

2. 细菌，真菌：

超氧阴离子含量（µmol/10⁴cell）= (A₅₃₀ +0.0038)÷0.0115×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×10^-3×2= 1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷细胞数量

超氧阴离子产生速率（µmol/mg prot·min）= 1.74×(A₅₃₀ +0.0038)÷细胞数量÷T

= 0.087×(A₅₃₀ +0.0038)÷细胞数量

3. 血清或培养液

超氧阴离子含量（μmol/L）= (A₅₃₀ +0.0038)÷0.0115 ×V反总÷V 样×2

= 1739.13×(A₅₃₀ +0.0038)

超氧阴离子产生速率（μmol/L·min）= 1739.13×(A₅₃₀ +0.0038) ÷T= 86.96×(A₅₃₀ +0.0038)

V 样总：加入提取液体积，1 mL； V 反总：反应总体积，0.4mL；V 样：反应中样品体积，0.04mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2: 2分子O₂^－参与反应生成1分子 NO₂^－。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y=0.00575x-0.0038，R²=0.9986

1. 组织：

（1）按照样本质量计算

超氧阴离子含量（μmol/g）= (A₅₃₀+0.0038)÷0.00575×V反总÷(V样÷V样总×W)×10^-3×2= 3.48×(A₅₃₀+0.0038)÷W

超氧阴离子产生速率（μmol/g·min）=3.48×(A₅₃₀ +0.0038)÷W÷T

=0.174×(A₅₃₀+0.0038)÷W

（2）按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量（μmol/mg prot）= (A₅₃₀ +0.0038)÷0.00575×V反总÷(V样×Cpr)×10^-3×2= 3.48×(A₅₃₀+0.0038)÷Cpr

超氧阴离子产生速率（μmol/mg prot·min）= 3.48×(A₅₃₀+0.0038)÷Cpr÷T

=0.174×(A₅₃₀+0.0038)÷Cpr

2. 细菌，真菌：

超氧阴离子含量（µmol/10⁴cell）= (A₅₃₀+0.0038)÷0.00575×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量)×10^-3×2= 3.48×(A₅₃₀+0.0038)÷细胞数量

超氧阴离子产生速率（µmol/10⁴cell·min）= 1.74×(A₅₃₀+0.0038)÷细胞数量÷T

=0.174×(A₅₃₀ +0.0038)÷细胞数量

3. 血清或培养液

超氧阴离子含量（μmol/L）= (A₅₃₀+0.0038)÷0.00575 ×V 反总÷V 样×2

= 3478.26×(A₅₃₀+0.0038)

超氧阴离子产生速率（μmol/L·min）= 3478.26×(A₅₃₀+0.0038) ÷T

= 173.91×(A₅₃₀ +0.0038)

超氧阴离子检测试剂盒V 样总：加入提取液体积，1 mL； V 反总：反应总体积，0.4mL；V 样：反应中样品体积，0.04mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2：2分子O₂^－参与反应生成1分子NO₂^－。

注意事项

1、 OD 值大于 1.5，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。

2、 样品制备好后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。

3、 试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。

4、 检出限为 0.33µmol/L。