硝酸还原酶（NR）检测试剂盒 返回列表页

硝酸还原酶（NR）检测试剂盒正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。

测定原理：

NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及 α - 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。

自备实验用品及仪器：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

硝酸还原酶（NR）检测试剂盒试剂的组成和配制：

诱导剂储备液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 10mL×1 瓶，-20℃保存。试剂二：液体 5mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存（如出现结晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）；试剂四：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：标准储备液 1mL，-20℃保存。

诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释 10 倍，即取 10mL 诱导剂储备液加 90mL 蒸馏水，充分混匀。

0.1umol/mL 的标准液的配制：用时将试剂五稀释 100 倍，即取 0.1ml 试剂五加 9.9mL 蒸馏水，充分混匀。

样品测定的前处理

组织的前处理：

（1） 取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡 2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻 30min，取出样本，滤纸吸干。（一般不要诱导处理，预测定结果没有活性则需要诱导处理）

（2） 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

细菌或培养细胞的前处理：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

硝酸还原酶（NR）检测试剂盒测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂）

混匀后，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）反应 30min

混匀，室温显色 20min，540nm 处比色注意：标准管和空白管只需测一次，每个测定管设一个对照管。

NR 活性计算：

（1） 按样本鲜重计算：

单位定义：每小时每g 鲜重样品中催化产生 1μ mol NO2ˉ的量为一个 NR 活力单位。

NR（μ mol/h/g 鲜重）= (C 标准管×V1)×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）

÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷W

（2） 按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每小时每 mg 组织蛋白催化产生 1μ mol NO2ˉ的量为一个 NR 活力单位。

NR（μ mol/h/mg prot）=(C 标准管×V1)×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）

÷(V1×Cpr)÷T=0.2×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr

硝酸还原酶（NR）检测试剂盒C 标准管：标准管浓度，0.1μ mol/mL；V1：加入样本体积：0.02mL；V2：加入提取液体积， 1mL；T：反应时间，0.5h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。