亚硝酸还原酶（NiR）检测试剂盒 返回列表页

亚硝酸还原酶（NiR）检测试剂盒微量法说明书

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的酶，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为NO或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。

测定原理：

亚硝酸还原酶可将NO2-还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2-减少， 即 540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、水浴锅、低温离心机。

亚硝酸还原酶（NiR）检测试剂盒试剂的组成和配制：

提取液：液体 112mL×1 瓶，4℃保存。试剂一：液体 4mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 5mL 蒸馏水溶解。

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解） 试剂四：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解） 试剂五：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以 1:1 的比例混合。

酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）；然后 10000g，4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作表：

酶活单位定义：每 104  个细胞每小时还原 1μ  mol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。NiR（μ  mol/h

/104 cell）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)-0.0072]÷0.6797×V 标÷（细胞数量×V 样

÷V 样总）÷T = 2.94×（A 空白管-A 测定管+A 对照管-0.0072）÷ 细胞数量

V 标：标准液体积，0.04mL；V 样：体系中加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积， 1mL；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g

亚硝酸还原酶（NiR）检测试剂盒注意事项:

1. 配制好的工作液 3 天内使用完。

2. 若吸光值超过 1.5，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。

3. 严格控制显色时间，否则会对结果有影响。

4. 标准曲线线性范围为 0.03μ mol/mL-1.5μ mol/mL。

A 空白管-（A 测定管-A 对照管）线性范围为 0.02-1.5。