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| 规格 | 50T/100T | 仪器 | 分光光度计/酶标仪 |
|---|---|---|---|
| 运输 | 常温/2-8℃ | 保质期 | 三个月 |
| 品牌 | 合肥莱尔生物科技有限公司 | 订购方式 | 联系客服 |
| 保存 | 详情见说明书 | 货期 | 现货 |
测定意义：
NADPase 主要存在于植物组织中，是生物体内唯1催化 NADP+降解为 NAD+的酶，与 NADK 一起调控 NAD 和 NADP 之间的平衡。
测定原理：
NADPase 能够催化 NADP+水解为 NAD+和无机磷的反应，通过测定无机磷的量来测定 NADPase 活性。
自备实验用品及仪器：
可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 15 mL×1 瓶， 4℃保存。
试剂二：粉剂×4 支，-20℃保存；用时加入 1 mL 试剂一充分溶解备用，现配现用。试剂三：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。试剂四：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃可保存一周。试剂五：液体 25mL×1 瓶，室温保存。
试剂六：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。
0.5μ mol/mL 标准磷应用液配制：将试剂六 20 倍稀释，即取 0.5mL 试剂六加 9.5 蒸馏水，充分混匀。
定磷试剂的配制：按H2O: 试剂三:试剂四:试剂五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂最好用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
NADP 磷酸酶（NADPase）检测试剂盒样本的前处理：
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
操作步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。
2、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂）
试剂名称（μ L） | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 120 | 120 |
试剂二 | 40 | 40 |
37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）预热 5min
样本 | 40 |
|
蒸馏水 |
| 40 |
37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确反应 30min 后，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g 25℃离心 5min，取上清
3、定磷（在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂）
| 标准管 | 空白管 | 测定管 | 对照管 |
0.5μ mol/ml 标准磷应用 液 | 20 |
|
|
|
蒸馏水 |
| 20 |
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上清液 |
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| 20 | 20 |
定磷试剂 | 200 | 200 | 200 | 200 |
NADP 磷酸酶（NADPase）检测试剂盒混匀，25℃室温放置 30min，在 660nm 处，记录各管吸光值。
注意事项：
1、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格，要没有一点磷，若试管放过磷酸或磷酸盐缓冲液，一定要洗得非常干净，要先用洗洁精加水煮，再用自来水冲， 最后用蒸馏水冲干净。最好用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是检测成败的关键。
2、标准管、空白管和对照管只要做一次即可。
NADPase 酶活性计算：
1、按组织蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白 NADPase 分解 NADP 产生 1μ mol 无机磷的量为一个 NADPase 活力单位。
NADPase (μ mol/h/mg prot)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷ (V 样×Cpr)÷T=5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
定义：每小时每 g 组织 NADPase 分解 NADP 产生 1μ mol 无机磷的量为一个 NADPase 活力单位。NADPase (μ mol/h /g 鲜重)=(C 标准管×V 总)×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管）
×V 总÷(W× V 样÷V 样总)÷T=5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W
NADP 磷酸酶（NADPase）检测试剂盒C 标准管：标准管浓度，0.5μ mol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.2mL；V 样：加入样本体积， 0.04mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，0.5 小时；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本鲜重，g。
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