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抗坏血酸过氧化物酶（APX）检测试剂盒微量法说明书
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化 H 2 O 2 氧化 AsA，是植 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到AsA 的含量，APX 与 AsA 具有一定的负相关性。
测定原理：
APX 催化H2O2氧化AsA，通过测定AsA氧化速率，来计算得APX 活性。
自备实验用品及仪器：
低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×2 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 3 mL 蒸馏水充分溶解。试剂三：液体×1 支，4℃保存。
抗坏血酸过氧化物酶（APX）检测试剂盒粗酶液提取：
按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
测定：
1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到290nm，用蒸馏水调零。
2. 试剂一在 25℃中预热 30min。
3. 依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μ L 上清液、140μ L 预热的试剂一 20μ L 试剂二和20μ  L 试剂三，迅速混匀后在 290nm 测定 10s 和 130s 光吸收 A1 和 A2，△A=A1-A2。
APX 活性计算：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1μ mol AsA 为 1 个酶活单位。APX(μ mol/min/mg prot) = △A÷(ε ×d）×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T
=1.79×△A÷ Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：每 g 组织每分钟氧化 1μ mol AsA 为 1 个酶活单位。APX(μ mol/min/g ) = △A÷(ε  ×d）×V 反总×106÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=1.79×△A ÷W
ε ：AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×103 L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μ L=2×10-4 L；106：1mol=1×106μ mol；Cpr：上清液蛋白质

浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量； V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μ L=0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T： 催化反应时间（min），2min。
抗坏血酸过氧化物酶（APX）检测试剂盒b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1μ mol AsA 为 1 个酶活单位。APX(μ mol/min/mg prot) = △A÷(ε ×d）×V 反总×106÷(Cpr×V 样)÷T
=3.58×△A÷ Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：每 g 组织每分钟氧化 1μ mol AsA 为 1 个酶活单位。APX(μ mol/min/g ) = △A÷(ε  ×d）×V 反总×106÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=3.58×△A ÷W
ε ：AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×10 3 L/mol/cm；d：96孔板光径（cm），0.5 cm； V反总：反应体系总体积（L），200μ L=2×10 -4 L；106：1mol=1×106μ mol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μ L=0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL； T：催化反应时间（min），2min。
抗坏血酸过氧化物酶（APX）检测试剂盒注意事项：
配制好的试剂二 4℃保存，并且 3 天内使用完