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脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）检测试剂盒

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
DHAR存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR催化GSH还原DHA生成AsA和GSSG，调控细胞AsA/DHA比值，是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的DHAR活性，可提高植物食品中AsA含量，进而提高植物食品的营养品质。
测定原理：
DHAR催化GSH还原DHA生成AsA，通过测定DHA减少速率，计算DHAR活性。
自备实验用品及仪器：
研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可调式移液器和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶（棕色），4℃保存。 临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解。试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。 临用前加入2.5 mL蒸馏水充分溶解。
脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）检测试剂盒粗酶液提取：
1. 按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；8000g 4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。
3. 血清等液体：直接测定。
DHAR 测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热30min。
3. 在微量石英比色皿/96孔板中依次加入20μ L上清液、20μ L试剂三、20μ L试剂四和140μ L 试剂二，迅速混匀后于265nm比色，记录30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A2-A1。
DHAR 活性计算公式：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成1nmol AsA为1个酶活单位。DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε ÷d×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T
= 92×△A ÷Cpr

按样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成1nmol AsA 为1个酶活单位。DHAR(nmol/min/g) = △A÷ε ÷d×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 92×△A ÷W
(3). 按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟还原生成1nmol AsA为1个酶活单位。DHAR(nmol/min/104cell) = △A÷ε  ÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
= 92×△A ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成1nmol AsA为1个酶活单位。DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε ÷d×V 反总×109÷V 样÷T
= 92×△A
ε ：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104L/mol/cm；106：摩尔分子换算成微摩尔分子；d： 比色杯光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4 L；V 样：反应体系中加入上清液体积，20μ L =0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；W ： 样品质量；T：反应时间，2 min。
脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）检测试剂盒b. 使用96孔板测定的计算公式如下(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成1nmol AsA为1个酶活单位。DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε ÷d×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T
= 184×△A÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成1nmol AsA为1个酶活单位。DHAR(nmol/min/g) = △A÷ε ÷d×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 184×△A ÷W
(3). 按细胞数量计算
活性单位定义：25℃中每104个细胞每分钟还原生成1nmol AsA为1个酶活单位。DHAR(nmol/min/104cell) = △A÷ε  ÷d×V 反总×109÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
= 184×△A ÷细胞数量
(4). 按液体体积计算
活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成1nmol AsA为1个酶活单位。DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε ÷d×V 反总×109÷V 样÷T
= 184×△A
脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）检测试剂盒ε ：AsA在265nm处摩尔吸光系数为 5.42×104L/mol/cm；106：摩尔分子换算