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规格 | 50T/100T | 仪器 | 分光光度计/酶标仪 |
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运输 | 常温/2-8℃ | 保质期 | 三个月 |
品牌 | 合肥莱尔生物科技有限公司 | 订购方式 | 联系客服 |
保存 | 详情见说明书 | 货期 | 现货 |
柠檬酸(CA)检测试剂盒微量法说明书,注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
CA 是生物体内常见的有机酸,是重要的食品风味物质。此外,CA 是三羧酸循环第一步反应的产物。
测定原理:
酸性条件下,柠檬酸还原 Cr6+生成 Cr3+,在 545nm 处有特征吸收峰;通过测定 545nm 吸光值的增加即可计算出样品中柠檬酸含量。
自备实验用品及仪器:
低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。
柠檬酸(CA)检测试剂盒试剂组成和配置:
试剂一:液体×2 瓶,4℃保存。试剂二:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体×1 管,-20℃保存。
试剂四:粉剂×1 管,室温保存。临用前配制,加入 2mL 试剂一,充分溶解。试剂五:液体×1 管,4℃避光保存。
标准品:液体×1 管,250μ mol/L 柠檬酸标准液,4℃保存。
样品中柠檬酸提取:
1. 液体样品中柠檬酸提取:取 0.1mL 液体加试剂一 0.9mL,充分混匀,11000g,4℃离心 10min,取上清液,待测。
2. 组织中柠檬酸提取:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。11000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
3. 线粒体中柠檬酸提取:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆,600g/min,4℃离心 5min;取上清至另一EP 管中,11000g,4℃离心 10min,弃上清(此上清液可用于细胞质 CA 含量测定);向沉淀中加试剂二 200μ l,以及试剂三 2μ l,充分悬浮溶解,11000g,4℃离心 10min,取上清液,待测。
4. 细菌、真菌中:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);11000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。
柠檬酸(CA)检测试剂盒测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min,调节波长到 545 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂一置于 30℃水浴中预热 30min。
3. 空白管:取 0.5 mL EP 管,依次加入 20μ L 蒸馏水,140μ L 试剂一,20μ L 试剂四,20μ L 试剂五,混匀后室温静置 30min,于 545nm 测定吸光度,记为A 空白管。
4. 标准管:取 0.5 mL EP 管,依次加入 20μ L 标准液,140μ L 试剂一,20μ L 试剂四,20μ L 试剂五,混匀后室温静置 30min,于 545nm 测定吸光度,记为A 标准管。
5. 测定管:取 0.5 mL EP 管,依次加入 20μ L 上清液,140μ L 试剂一,20μ L 试剂四,20μ L 试剂五,充分混匀后室温静置 30min,于 545nm 测定吸光度,记为A 测定管。
注意:空白管和标准管只需测定一次。
计算公式:
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1. 按液体样品的体积计算
柠檬酸含量(nmol/L)= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×样品稀释倍数×V 总
= 2500×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)
C 标准液:250μ mol/L=0.25 m mol/L;样品稀释倍数:(0.1 mL 样品+0.9mL 试剂一)÷ 0.1 mL样品=10;V 总:1mL。
2. 按组织质量计算
柠檬酸含量(nmol/g 鲜重)= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×V
总÷W
= 250×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W C 标准液:250 μ mol/L;V 总:上清液总体积,1.0 mL=0.001 L;W:样品质量,g。
3. 按蛋白含量计算
柠檬酸含量(nmol/mg prot)= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]÷Cpr
= 250×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷Cpr C 标准液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白质含量,mg/mL。
4. 按细胞数量计算
柠檬酸含量(nmol/104 cell)= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×V
总÷细胞数量
= 250×(A 测定管-A 空白管) ÷(A 标准管-A 空白管) ÷细胞数
量
C 标准液:250 μ mol/L;V 总:上清液总体积,1.0 mL=0.001 L;
b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下
3. 按液体样品的体积计算
柠檬酸含量(nmol/L)= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×样品稀释倍数×V 总
= 2500×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)
C 标准液:250μ mol/L=0.25 m mol/L;样品稀释倍数:(0.1 mL 样品+0.9mL 试剂一)÷ 0.1 mL样品=10;V 总:1mL。
4. 按组织质量计算
柠檬酸含量(nmol/g 鲜重)= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×V
总÷W
= 250×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷W C 标准液:250 μ mol/L;V 总:上清液总体积,1.0 mL=0.001 L;W:样品质量,g。
柠檬酸(CA)检测试剂盒5. 按蛋白含量计算
柠檬酸含量(nmol/mg prot)= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]÷Cpr
= 250×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) ÷Cpr C 标准液:250 μ mol/L=0.25μ mol/mL;Cpr:上清液蛋白质含量,mg/mL。
6. 按细胞数量计算
柠檬酸含量(nmol/104 cell)= [C 标准液×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管)]×V
总÷细胞数量
= 250×(A 测定管-A 空白管) ÷(A 标准管-A 空白管) ÷细胞数
量
C 标准液:250 μ mol/L;V 总:上清液总体积,1.0 mL=0.001 L;
注意事项:
1. 样品处理等过程均需要在冰上进行。
2. 试剂四需现配现用,配置好的一周内使用完;
3. 试剂五为易致癌物质,实验过程中,需佩戴手套,避免试剂五溅到皮肤上。
4. 柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定,如需测定蛋白含量,需另取组织,使用本公司 BCA 试剂盒进行测定。
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