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K-ETOH乙醇检测试剂盒以下文字为中文翻译，具体操作以英文版说明书为准，报价及货期联系我司客服。

（*60个手动化验/试剂盒）或（每套件600个自动分析仪分析）或（每包600个微量板分析）

简介：

乙醇在自然发生中无处不在，因此，乙醇的定量测定不仅对生产醉酒、啤酒和烈性酒都很重要，而且对于低酒精和非酒*料、果汁和一系列其他食品，包括巧克力、糖果、果酱、蜂蜜、醋和乳制品都具有重要意义。大量非食品中也含有大量乙醇，如化妆品和药品。

原则：

乙醇的定量需要两种酶反应；在乙醇脱氢酶（ADH）催化的第一反应中，乙醇被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）（1）氧化为乙醛。⁺

（ADH）

（1） 乙醇+NAD⁺乙醛+NADH+H⁺

然而，由于反应（1）的平衡有利于乙醇和NAD，因此需要进一步的反应来“捕获”产物。这是通过乙醛脱氢酶（Al-DH）和NAD（2）存在下乙醛氧化为乙酸实现的。⁺⁺

（Al DH）

（2） 乙醛+NAD+HO⁺₂乙酸+NADH+H⁺

该反应过程中形成的NADH的量是乙醇量的两倍的化学计量。它是通过340nm处吸光度的增加测量的NADH（图1，第12页）。

特异性、灵敏度、线性和精确度：

在分析过程中试剂的添加顺序消除了醛和酮的任何可能干扰。甲醇由于所用酶的K值不利而无法转化。对乙醇进行了优化，同时也实现了正丙醇和正丁醇的定量转化。较高的初级醇反应速度显著降低，在目前情况下，可能导致样品依赖的蠕变反应。_m

该方法的最小鉴别吸光度为0.005吸光度单位。这对应于最大样品体积为2.00 mL的样品溶液的0.023 mg/L。检测限为

0.093 mg/L，其来源于吸光度差为0.020，最大样品体积为2.00 mL。

该方法在每次测定0.25至12μg乙醇范围内呈线性关系。在使用一个样品溶液进行重复测定时，可能发生0.005至0.010的吸光度差。样品体积为2.00 mL时，这对应于样品溶液的乙醇浓度约为0.023至0.046 mg/L。如果样品在样品制备过程中被稀释，则结果乘以稀释系数F。如果在样品制备过程中，称重样品，例如10 g/L，则可预期差值为0.02至0.05 g/100 g。

干扰：

蒸馏水中存在的醇和用于分析的缓冲液或空气中，可导致空白增加或蠕变反应。因此，在测定过程中，必须覆盖试管。

如果乙醇的转化在试验规定的时间内完成（约5分钟），则一般可以得出结论，没有发生干扰。但是，在反应完成后，可向反应杯中加入乙醇（约5μg in 0.1ml）进一步检查。应观察到吸光度显著增加。

分析样品中的干扰物质可通过包括内部标准来识别。预计将对该标准进行定量恢复。通过进行回收试验，即在初始提取步骤中向样品中添加乙醇，确定样品处理和提取过程中的损失。

安全性：

应遵守适用于所有化学物质的一般安全措施。

有关本产品安全使用和处理的更多信息，请参阅Megazyme网站上提供的相关SDS。

套件：

适用于手动格式（或600份自动分析仪格式的分析或600份微型板格式分析）的试剂盒可从Megazyme获得。该试剂盒包含完整的分析方法和：

试剂溶液/悬浮液的制备：

1.            使用所提供的瓶子1的内容。在4°C下稳定2年以上。

2.            将瓶2的含量溶于12.4 mL蒸馏水中。

在4°C下稳定1年以上或在-10°C以下稳定2年以上（为避免重复的冻融循环，将其分成适当尺寸的小报价，并储存在聚丙烯管中）。

3和4。使用所提供的瓶子3和4的内容物。在打开之前，摇动瓶子，以去除可能已固定在橡胶塞上的任何酶。随后，将瓶子存放在直立位置。使用前，旋动瓶子混合内容物。

               在4°C（ADH）或低于-10°C（Al DH）下稳定2年以上。

5.用蒸馏水稀释0.5ml瓶中5至50 mL的含量。存放在密封良好的杜兰瓶中。稀释后，该溶液在4°C下稳定2天。^®

K-ETOH乙醇检测试剂盒注：仅在对所用分光光度计的准确性或怀疑样品中物质引起抑制的地方，才对乙醇标准溶液进行分析。乙醇浓度直接由NADH的消光系数确定（第4页）。

设备（推荐）：

1.      容量瓶（50毫升和100毫升）。

2.      一次性塑料试管（1厘米光程，3.0毫升）。

3.      微型吸管器，例如Gilson Pipetman（20μL和100μL）。^®

4.      正位移管器，例如Eppendorf多个^®

-      用5.0 mL Combiti[分配0.2 mL缓冲液（瓶1）和NAD溶液]。^®+

-      加入25.0 mL Combiti（分配2.0 mL蒸馏水）。^®

5.      分析平衡。

6.      分光光度计设置为340nm。

7.      涡流混合器（例如IKA黄线试管振动台TTS2）。^®

8.      Whatman 1号（9厘米）滤纸。

A、 手动分析程序：

逆风阅读（光路中没有反应杯）或防水

*例如，使用微型平板振动器，在微型读卡器上摇动功能或重复抽吸（例如，使用50-100μL体积的吸管器）。

**如果样品的“蠕变”率大于空白，则将样品吸光度推回到悬浮液4的加入时间。

计算：

测定空白和样品的吸光度差（A-A）。从样品吸光度差中减去空白吸收差，从而获得δa。δa的值应至少为0.100个吸光度单位，以获得足够精确的结果。_{21乙醇乙醇}

乙醇浓度可计算如下：

c=V x MW xΔA[g/L]

                              εx d x v x 2

哪里：

V=最终体积[mL]

MW=乙醇分子量[g/mol]

ε=340nm时NADH的消光系数

=6300[l x mol x cm]d=光路[cm]v=样品体积[mL]^-1-1

2=每摩尔乙醇产生的2摩尔NADH

乙醇的使用情况如下：

c=2.57 x 46.07 xΔA[g/L]_乙醇

6300 x 1.0 x 0.10 x 2

=0.09397 xΔA[g/L]_乙醇

乙醇的（v/v）术语如下：

c=2.57 x 46.07 x 0.1266 xΔA[%（v/v）]_乙醇

6300 x 1.0 x 0.10 x 2

=0.01190 xΔA[%（v/v）]_乙醇

哪里：

0.1266=将g/L转化为%（v/v）的因子，取纯乙醇的密度为0.79g/mL。

如果样品在制备过程中被稀释，则必须将结果乘以稀释系数F。

分析样品制备称重的固体和半固态样品时，根据称重量计算含量（g/100g），如下所示：

乙醇含量

=西坦醇[g/L样品溶液]x 100[g/100 g]

重量[g/L样品溶液]_样品

注：这些计算可以通过使用Megazyme MegaCalc进行简化，可从产品出现在Megazyme网站上的位置下载^M

B、 自动分析仪分析程序：

笔记：

1.     乙醇自动分析仪测定程序可使用单点标准或全校准曲线执行。

2.     对于用于乙醇测定的每批样品，必须同时使用同一批试剂同时执行单点标准或校准曲线。

试剂制备如下：

R1的准备：

R2的制备：

示例方法：

C、 微量板分析程序：

笔记：

1.     乙醇的微板分析程序可以使用单点标准或全校准曲线执行。

2.     对于用于乙醇测定的每批样品，必须同时使用同一批试剂同时执行单点标准或校准曲线。

*例如，使用微型平板振动器，在微型读卡器上摇动功能或重复抽吸（例如，使用50-100μL体积的吸管器）。

**如果样品的“蠕变”率大于空白，则将样品吸光度推回到悬浮液4的加入时间。

计算（微量板分析程序）：g/L=ΔA x g/L标准x F_样品

                         Δ阿斯坦达

如果样品在制备过程中被稀释，则必须将结果乘以稀释系数F。

样品制备：

1样品稀释。

试管中存在的乙醇量（即在分析的0.1mL样品中）应在0.25至12μg之间。因此，必须充分稀释样品溶液，以产生0.01至0.12 g/L之间的浓度。

稀释表

K-ETOH乙醇检测试剂盒如果ΔA值过低（例如<0.100），则应称量更多样品或稀释较少。或者，将要被管道输送到反应杯中的样品体积可增加到2.00 mL，确保反应中的样品和蒸馏水组分之和为2.10 mL，并使用方程式中的新样品体积。_乙醇

2样品处理。

由于乙醇易挥发，所有操作应在可能的情况下，在密封的杜兰玻璃瓶中进行。^®

同时，在管道、稀释和过滤溶液中也要格外小心。取取等份前，用溶液冲洗配药管的塑料尖3次。试管和塑料尖duan应用无水蒸馏水冲洗3次，使用前干燥。

确保试剂瓶（特别是蒸馏水容器）在移除所需体积后立即密封，以尽量减少酒精从空气中的吸收。在建立测定时，不要使用用于引用乙醇标准或其他浓缩乙醇溶液的移液管。

三。样品澄清。

a、 解决方案：

卡雷斯一号解决方案。溶解3.60 g铁氰hua钾（II）{K[Fe（CN）].3HO}（Sigma cat）。编号P9387）100毫升蒸馏水。室温下存放。₄₆₂

Carrez II解决方案。溶解7.20 g硫酸锌（ZnSO.7HO）（Sigma cat。编号Z4750）100毫升蒸馏水。室温下存放。₄₂

氢氧化钠（NaOH，100 mM）。将4g NaOH溶解在1 L蒸馏水中。室温下存放。

b、 程序：

将液体样品移到100 mL容量瓶中，其中含有约60 mL蒸馏水，或将足够数量的样品称为100 mL容量瓶，并添加60 mL蒸馏水。小心地加入5毫升卡雷斯一号溶液、5毫升卡雷斯II溶液和10毫升NaOH溶液（100 mM）。每次添加后混合。将容量瓶加注至标记处，混合并过滤。

4一般考虑事项。

（a） 液体样品：测定中可直接使用透明、略带颜色和近似中性的液体样品。

（b） 酸性样品：如果未稀释（如葡萄酒或果汁）使用大于0.1 mL的酸性样品，则应使用2 M NaOH将溶液的pH值提高到约9.0，并在室温下孵育30 min。

（c） 二氧化碳：含有大量二氧化碳的样品，如啤酒，应通过将pH值增加至约9.0（用2 M NaOH）和温和搅拌或用玻璃棒搅拌来脱气。

（d） 彩色样品：对于有色样品，可能需要额外的空白样品，即无ADH的样品。

（e） 强颜色样品：如果使用未稀释，应通过添加0.2 g聚乙烯醇（PVPP）/10mL样品处理强颜色样品。用力摇动管5分钟，然后通过Whatman 1号滤纸过滤。

（f） 固体样品：在蒸馏水中均匀化或粉碎固体样品，必要时过滤。

（g） 含脂肪的样品：在脂肪熔点以上的温度下，例如在60°C下的100 mL容量瓶中，用热水提取此类样品。调节至室温，并用蒸馏水将容量瓶填充到标记处。在冰上或冰箱中存放15-30分钟，然后过滤。丢弃前几毫升滤液，并使用清清上清液（可能稍有乳白色）进行分析。或者，用Carrez试剂澄清。

（h） 含蛋白质的样品：（i）含有微生物的样品：用高氯酸去蛋白样品；或者用Carrez试剂澄清。使用注射器装置通过0.2微米过滤器过滤样品。

样品制备示例：

（a） 酒中乙醇的测定。

白葡萄酒和红酒的乙醇浓度一般不需任何样品处理即可测定（稀释表稀释除外）。通常，对于乙醇含量为10-15%（v/v）的葡萄酒，稀释度为1:1000，样品体积为0.1mL是令人满意的。

（b） 啤酒、苹果酒和酒精果汁中乙醇的测定。

将溶液pH升高至约9，用2m NaOH，温和搅拌去除二氧化碳后，按稀释表稀释样品，并进行分析。通常，对于3-8%（v/v）乙醇的饮料，稀释1:500和样品体积为0.1ml是令人满意的。

（c） 非酒精和低酒精啤酒及其他饮料中乙醇的测定。

将溶液pH值提高至约9.0，用2m NaOH去除二氧化碳后，轻轻搅拌，按稀释表稀释样品，并进行分析。通常，稀释1:50和样品体积为0.1ml是令人满意的。

（d） 酒精（威士忌、白兰地等）中乙醇的测定。一般不需要任何样品处理（根据稀释表稀释除外）即可测定烈性酒精浓度。但是，应注意，一般需要两个稀释步骤。通常，对于30-60%（v/v）乙醇的酒精，稀释1:10000和样品体积为0.1ml是令人满意的。

（e） 果汁、浓缩液及相关饮料中乙醇的测定。

一般不需要任何样品处理即可测定透明中性溶液的乙醇浓度（根据稀释表稀释除外）。未稀释使用时，应使用2m NaOH将酸性溶液的pH值提高到约9.0。浊液一般只需要在稀释步骤之前进行过滤。着色溶液通常适用于稀释至适当乙醇浓度后的分析。但是，如果有色溶液需要分析，则可能需要进行脱色处理，具体如下：使用聚乙烯醇（PVPP）或活性炭处理溶液

2 g/100 mL，并通过Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤。通常，不需要稀释，样品体积应达到0.5 mL。

（f） 固体食品（如利口酒巧克力）中乙醇的测定。

必要时，使用砂浆或均质剂使固体食品均匀化（~10 g）。将2 g代表性材料加入50 mL无乙醇水中，并在密封的Duran瓶中搅拌30分钟（必要时加热60°C）。冷却提取物（如有必要），并定量转移至100毫升容量瓶。用无水乙醇稀释至标记。过滤浊度溶液，必要时稀释（根据稀释表），并进行分析。通常，稀释1:10和样品体积为0.1ml是令人满意的。^®

（g） 醋中乙醇的测定。

一般来说，对醋的分析只需要在分析前过滤和稀释。然而，在过滤前，应使用2m NaOH将待分析样品的pH值提高到大约9.0。通常，稀释1:20和样品体积为0.1ml是令人满意的。

（h） 果酱中乙醇的测定。

准确称量约5 g代表性材料至100 mL Duran瓶中，并用50 mL无水乙醇萃取，搅拌30 min，60°C（密封瓶）。^®

冷却提取物，如果是酸性，使用2 M NaOH将pH值调整至9.0。定量地将溶液转移到100ml容量瓶中，并用无水乙醇调节体积至标记。过滤浊度溶液，必要时根据稀释表稀释。通常，不需要稀释，样品体积应达到0.5 mL。

（i） 蜂蜜中乙醇的测定。

准确称量约10 g代表性物质至100 mL容量瓶，其中含有40 mL无水乙醇，并立即将烧瓶塞住。蜂蜜在60℃下轻轻搅拌10分钟，冷却后，用无水乙醇调节至标记。过滤浊度溶液，必要时根据稀释表稀释。通常，不需要稀释，样品体积应达到0.5 mL。

（j） 乳制品中乙醇的测定。

准确称量约10 g代表性材料至100 mL Duran瓶中，并用50 mL无水乙醇萃取，搅拌30 min，60°C（密封瓶）。冷却提取物，定量地将溶液转移到100ml容量瓶中，并用无水乙醇调节体积至标记。过滤浊度溶液，必要时根据稀释表稀释。通常，不需要稀释，样品体积应达到0.5 mL。^®

（k） 未经消毒的红茶茶中乙醇的测定。

使用注射器装置通过0.2微米过滤器过滤，去除微生物。通过在旋涡混合器上混合约30 s，从样品中去除残余气体。通常，稀释1:200和样品体积为0.1ml是令人满意的。

K-ETOH乙醇检测试剂盒参考：

Beutler，H.O.（1988）。乙醇。“酶分析方法”（Bergmeyer，H.U.，ed），第3版，第六卷，第598-606页，VCH出版社（英国）有限公司，英国剑桥。