纤维素试剂盒检测方法

纤维素试剂盒检测方法供应商：合肥莱尔生物科技有限公司
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
规格：50T/48S 
测定意义：
纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，是植物细胞壁的主要结构成分。纤维素是一种重要的膳食纤维，是自然界中分布*、含量最多的一种多糖。
纤维素试剂盒检测方法测定原理：
纤维素为β－葡萄糖残基组成的多糖，在酸性条件下加热能分解成β－葡萄糖。β－葡萄糖在强酸作用下，可脱水生成β－糠醛类化合物。β－糠醛类化合物与蒽酮脱水缩合，生成糠醛衍生物。颜色的深浅可间接定量测定纤维素含量。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、80％乙醇、丙酮、浓硫酸（不允许快递）、研钵和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：液体 50mL× 1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体 10mL× 1 支，4℃保存。
标准品：粉剂10mg× 1支，4℃保存；含 10mg 无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用前加入 1mL 蒸馏水溶解，配制成 10mg/mL 葡萄糖溶液备用，4℃可保存 1 周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，可保存更长时间。
样品的前处理：
1、细胞壁的提取：取约 0.3g 样本（计为M1），加入 1mL 80％乙醇，室温快速匀浆，95℃水浴 20min，冷却至室温，4000g 25℃离心 10min，弃上清。沉淀加入 1.5mL80％乙醇和丙酮各洗一遍（涡旋振荡 2min 左右，4000g 25℃离心 10min，弃上清即可），沉淀即为粗细胞壁，加入 1mL 试剂一（去除淀粉）浸泡 15 小时，4000g 25℃离心 10min，弃上清，1mL 80％乙醇洗涤两次，弃上清，将沉淀干燥，称重得细胞壁物质（CWM质量计为M2）。
2、纤维素的提取：称取烘干的 CWM 约 5mg（计为W），加入 0.5mL 蒸馏水充分匀浆，匀浆液转移至 EP 管中，用蒸馏水定容至 0.5mL，置于冰水浴中，缓慢加入 0.75mL 浓硫酸，混匀，冰水浴中静置 30min。8000g 4℃离心 10min，取上清液，用蒸馏水稀释 20 倍后待测。
标准溶液准备：
将 10mg/mL 葡萄糖标准液进行二倍稀释得到 0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.00156mg/mL 标准溶液备用。
纤维素试剂盒检测方法测定步骤：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 620nm，蒸馏水调零。
2、调节水浴锅至 95 度。
3、工作液的配制：在试剂二中加入 4mL 试剂三，充分溶解，如较难溶解，可加热搅拌；用
不完的试剂 4℃保存一周；
4、加样表（在 EP 管中反应）：

混匀，置 95度水浴中 10min（盖紧，以防止水分散失），冷却至室温后，于 620nm 处读数。
纤维素试剂盒检测方法纤维素含量计算：
1、标准曲线绘制：
以 0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.00156mg/mL 葡萄糖标准溶液为横坐标，ΔA 为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程 y=kx+b，将ΔA´代入方程得到 x（mg/mL）；
2、按细胞壁干重计算
纤维素含量(mg/mg 鲜重)=x×稀释倍数×V 提取÷W
3、按总样本质量计算
纤维素含量(mg/mg 鲜重)=x×稀释倍数×V 提取÷W×M1÷M2
V 提取：提取后体积，1.25mL；W：样品质量，mg；稀释倍数：20；M1：总样本质量，g；M2：细胞壁物质CWM，g
注意事项
1. 加热过程中有剧烈反应，震荡时轻摇，以免压力过大喷出造成人生伤害。
2. 浓硫酸具有强腐蚀性，建议戴防护手套操作。
3. 如样本OD值大于1.5，可在纤维素提取过程中扩大稀释倍数，计数过程中乘以对应的稀释倍数。